Микрофокус рентгеновских КТ (микроКТ) Изображение Эктинии эквины (Cnidaria), Harmothoe sp. (Аннелида), и Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Summary
Здесь подробно описаны протоколы для выполнения микрофокусированной рентгеновской компьютерной томографии (микроКТ) изображений трех морских беспозвоночных животных. В этом исследовании описаны такие этапы, как фиксация образцов, окрашивание, монтаж, сканирование, реконструкция изображений и анализ данных. Предложения о том, как протокол может быть скорректирован для различных образцов также представлены.
Abstract
Традиционно биологам приходилось полагаться на разрушительные методы, такие как секционирование, чтобы исследовать внутренние структуры непрозрачных организмов. Неразрушающая микрофокусная рентгеновская компьютерная томография (microCT) стала мощным и зарождающимся протоколом в биологии, благодаря технологическим достижениям в методах окрашивания образцов и инновациях в оборудовании микрокТ, обработке компьютеров и данных аналитического программного обеспечения. Однако этот протокол обычно не используется, как и в медицинской и промышленной областях. Одной из причин такого ограниченного использования является отсутствие простого и понятного руководства, которое охватывает все необходимые этапы: сбор образцов, фиксацию, окрашивание, монтаж, сканирование и анализ данных. Другой причиной является огромное разнообразие метазоанов, особенно морских беспозвоночных. Из-за различных размеров, морфологий и физиологий морских беспозвоночных крайне важно корректировать экспериментальные условия и аппаратные конфигурации на каждом этапе, в зависимости от образца. Здесь методы микроктовой визуализации подробно описаны с помощью трех филогенетически разнообразных морских беспозвоночных: Actinia equina (Антхозоа, Книдария), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) и Xenoturbella japonica ( Ксенотурбеллида, Ксенакоэломорфа). Предложения по выполнению микрокт-изображений на различных животных также предоставляются.
Introduction
Биологические исследователи, как правило, были вынуждены делать тонкие секции и выполнять наблюдения с помощью световой или электронной микроскопии для того, чтобы исследовать внутренние структуры непрозрачных организмов. Однако эти методы являются разрушительными и проблематичными при применении к редким или ценным особям. Кроме того, несколько этапов в методе, таких как встраивание и секция, отнимают много времени, и это может занять несколько дней, чтобы наблюдать образец, в зависимости от протокола. Кроме того, при обработке многочисленных секций всегда есть возможность повреждения или потери некоторых секций. Техника очистки тканей доступнадля некоторых образцов 1,2,3,4,5, но еще не применимы для многих видов животных.
Чтобы преодолеть эти проблемы, некоторые биологи начали использовать микрофокус рентгеновскойкомпьютерной томографии (микроКТ) изображений 6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. В рентгеновской КТ, образец облучается рентгеновскими лучами с различных углов, которые генерируются из рентгеновского источника, движущегося вокруг образца, и передаваемые рентгеновские лучи контролируются детектором, который также движется вокруг образца. Полученные данные о передаче рентгеновских лучей анализируются для восстановления поперечных изображений образца. Этот метод позволяет наблюдать внутренние структуры без разрушения образца. Из-за своей безопасности и легкости, он широко используется в медицинских и стоматологических приложений, и КТ системы могут быть найдены в больницах и стоматологических центрах по всему миру. Кроме того, промышленный рентгеновский КТ часто используется для наблюдения за немедицинскими образцами для осмотра и метрологии в промышленной сфере. В отличие от медицинской КТ, при которой рентгеновский источник и детекторы подвижны, две части фиксируются в промышленной КТ, при этом образец вращается во время сканирования. Промышленный КТ обычно производит изображения с более высоким разрешением, чем медицинский КТ, и называется микроКТ (разрешение уровня микрометра) или nanoCT (разрешение уровня нанометра). В последнее время исследования с использованием микроCT быстро увеличилось в различных областях биологии14,15,16,17,18,19, 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33 , 34.
Биологические исследования с использованием КТ первоначально целевых внутренних структур, которые в основном состоят из твердых тканей, таких как кости. Достижения в области методов окрашивания с использованием различных химических агентов позволили визуализировать мягкие ткани в различных организмах6,7,8,9,14,15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33 , 34. Из этих реагентов контрастные агенты на основе йода относительно безопасны, недороги и могут быть использованы для визуализации мягких тканей в различных организмах7,14. Что касается морских беспозвоночных, микрокт широко используется на таких животных, как моллюски6,25,32,33, annelids18,19, 20 , 28, и тортоподы21,23,29,31. Тем не менее, было несколько сообщений о других животных phyla, таких как bryozoans6, xenacoelomorphs26, и книдарий24,30. В целом, было меньше исследований с использованием микроКТ на морских беспозвоночных, чем на позвоночных. Одной из основных причин такого ограниченного использования морских беспозвоночных является огромное разнообразие, наблюдаемое у этих животных. Из-за своих разнообразных размеров, морфологии и физиологии, каждый вид по-разному реагирует на различные экспериментальные процедуры. Поэтому при подготовке к образу отбора крайне важно выбрать наиболее подходящую фиксацию и окрашивающий реагент, а также установить условия на каждом шагу, скорректированные для каждого вида. Аналогичным образом, необходимо также установить конфигурации сканирования, такие как метод монтажа, напряжение, текущая, механическая скорость увеличения и мощность разрешения пространства, соответствующая для каждого образца. Для решения этой проблемы необходимо простое и понятное руководство, которое охватывает все необходимые шаги, объясняет, как каждый шаг может быть скорректирован в зависимости от образца, и показывает подробные примеры из нескольких образцов.
В настоящем исследовании мы описываем протокол микрокт-изображения шаг за шагом, от фиксации образцов до анализа данных с использованием трех видов морских беспозвоночных. Образцы морского анемона Actinia equina (Антхозоа, Книдария) были собраны вблизи морской биологической станции Мисаки, Токийский университет. У них было сферическое, мягкое тело диаметром около 2 см(рисунок 1A-C). Вблизи морской биологической станции Мисаки были также собраны образцы Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida). Они были стройные черви, которые были около 1,5 см в длину, с жесткими chaetae настоящее время вдоль всего тела (Рисунок 1D). Образец Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) был собран вблизи морского исследовательского центра Симода, Университет Цукуба, во время 13-го совместного обследования прибрежных организмов JAMBIO. Это был мягкотелый червь длиной около 0,8 см(рисунок 1E). Подробно разъясняются корректировки условий и конфигураций каждого образца. Наше исследование содержит несколько предложений о том, как выполнять микрокт изображения морских беспозвоночных, и мы надеемся, что это вдохновит биологов использовать этот протокол для своих исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фиксatives использованием формалина, таких как 10% (v/v) формалин решение в морской воде, используемой в этом исследовании, как известно, сохранить морфологию различных морских беспозвоночных и часто используются для микроct-изображений18,24,25 </sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Тосихико Шириси за помощь и за предоставление исследовательской среды в ходе этого исследования. Мы благодарны Кенсукэ Янаги и Такато Идзуми за советы по A. equina, и Масаацу Танака за советом по Harmothoe sp. образца. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников Морского исследовательского центра Симода, Университета Цукуба и морской биологической станции Мисаки, Токийского университета, за помощь в сборе проб. Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование английского языка. Эта работа была поддержана Грантом JSPS для молодых ученых (A) (JP26711022) для HN и JAMBIO, Японской ассоциацией морской биологии.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
