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Environment

마이크로 포커스 X 선 CT (마이크로CT) 액티니아 에퀴나의 이미징 (Cnidaria), 하모토 sp. (안넬리다), 그리고 Xenoturbella 자포니카 (제나코엘로모파)

Published: August 06, 2019
doi:
10.3791/59161
, , ,
1Mammalian Genetics Laboratory,National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station,The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center,University of Tsukuba

Summary

여기서, 3마리의 해양 무척추동물에 대한 마이크로포커스 X선 컴퓨터 단층촬영(microCT) 영상을 수행하기 위한 프로토콜을 상세히 설명한다. 이 연구에서는 샘플 고정, 염색, 장착, 스캐닝, 이미지 재구성 및 데이터 분석과 같은 단계를 설명합니다. 다양한 샘플에 대해 프로토콜을 조정할 수 있는 방법에 대한 제안도 제공됩니다.

Abstract

전통적으로 생물학자들은 불투명한 유기체의 내부 구조를 조사하기 위해 절제와 같은 파괴적인 방법에 의존해야 했습니다. 비파괴 마이크로포커스 X선 컴퓨터 단층 촬영(microCT) 이미징은 마이크로CT 하드웨어, 프로세싱 컴퓨터 및 데이터의 샘플 염색 방법 및 혁신분야의 기술 발전으로 인해 생물학 분야에서 강력하고 새로운 프로토콜이 되었습니다. 분석 소프트웨어. 그러나 이 프로토콜은 의료 및 산업 분야에서 일반적으로 사용되지 않습니다. 이러한 제한된 사용 이유 중 하나는 샘플 수집, 고정, 염색, 장착, 스캔 및 데이터 분석과 같은 필요한 모든 단계를 다루는 간단하고 이해하기 좋은 설명서가 없기 때문이다. 또 다른 이유는 메타조안, 특히 해양 무척추 동물의 광대 한 다양성이다. 해양 무척추 동물의 다양한 크기, 형태 학 및 생리로 인해 샘플에 따라 각 단계에서 실험 조건 및 하드웨어 구성을 조정하는 것이 중요합니다. 여기서, 마이크로CT 이미징 방법은 세 가지 계통유전학적으로 다양한 해양 무척추 동물을 사용하여 자세히 설명됩니다: 액티니아 에퀴나(안토조아, 소니다리아), 하모토스p. (폴리채타, 안넬리다), 그리고 제노투르벨라 자포니카 ( 제노투르벨리다, 제나코멜로모파). 다양한 동물에 대한 마이크로CT 이미징 수행에 대한 제안도 제공됩니다.

Introduction

생물학 연구원은 일반적으로 불투명한 유기체의 내부 구조물을 조사하기 위하여 얇은 단면도를 만들고 빛 또는 전자 현미경 검사법에 의하여 관측을 능력을 발휘해야 했습니다. 그러나 이러한 방법은 희귀하거나 귀중한 표본에 적용할 때 파괴적이고 문제가 됩니다. 또한 포함 및 단면화와 같은 메서드의 여러 단계는 시간이 많이 소요되며 프로토콜에 따라 샘플을 관찰하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 또한, 수많은 섹션을 처리 할 때, 손상 또는 일부 섹션을 잃을 가능성이 항상있다. 조직 제거 기술은 일부 시편1, 2,3,4,5에 사용할 수 있지만 아직 많은 동물 종에 적용되지 않습니다.

이러한 문제를 극복하기 위해 일부 생물학자들은 마이크로 포커스 X 선 컴퓨터 단층촬영 (microCT) 이미징 6, 7,8,9,10,11을사용하기 시작했습니다. 12,13,14,15. X 선 CT에서, 견본은 견본의 주위에 이동하는 엑스레이 근원에서 생성되는 각종 각도에서 엑스레이로 조사되고, 전송된 엑스레이는 또한 견본의 주위에 움직이는 검출기에 의해 감시됩니다. 얻어진 X선 전송 데이터는 표본의 단면 이미지를 재구성하기 위하여 분석됩니다. 이 방법을 사용하면 샘플을 파괴하지 않고 내부 구조를 관찰 할 수 있습니다. 그것의 안전과 용이성 때문에, 그것은 일반적으로 의료 및 치과 응용 프로그램에서 사용되며, CT 시스템은 전 세계 병원과 치과 센터에서 찾을 수 있습니다. 또한 산업용 X선 CT는 산업 분야의 검사 및 계측을 위해 비의료 시료를 관찰하는 데 자주 사용됩니다. X선 소스와 검출기가 이동되는 의료 용 CT와 달리 두 부품은 산업용 CT에 고정되어 있으며 스캔 중에 샘플이 회전합니다. 산업용 CT는 일반적으로 의료 용 CT보다 고해상도 이미지를 생성하며 마이크로 CT (마이크로 미터 수준 해상도) 또는 나노 CT (나노 미터 수준의 해상도)라고합니다. 최근, microCT를 이용한 연구는 생물학 14,15,16,17,18,19, 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27세 , 28세 , 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34.

CT를 이용한 생물학적 연구는 주로 뼈와 같은 단단한 조직으로 구성되는 내부 구조물을 표적으로 했습니다. 다양한 화학 약체를 이용한 염색 기술의 발전으로 다양한 유기체6,7,8,9,14,15에서 연조직의 시각화가 가능 , 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27세 , 28세 , 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34.이들 시약 중, 요오드계 조영제는 비교적 안전하고 저렴하며, 다양한 유기체에서연조직의 가시화에 사용될 수 있다 7,14. 해양 무척추 동물에 관해서는, microCT는 연체 동물6,25,32,33,annelids18,19, 20개 , 28, 및 arthoropods21,23,29,31. 그러나, 다른 동물 필라에 대한 보고는 거의 없었으며, 이러한 bryozoans6,제나코멜로모프26,및 cnidarians24,30. 일반적으로, 척추 동물에 비해 해양 무척추 동물에 microCT를 사용 하 여 적은 연구 되었습니다. 해양 무척추 동물에 이 제한적인 사용에 대 한 한 가지 주요 이유는 이 동물에서 관찰 하는 광대 한 다양성. 그들의 다양한 크기 때문에, 형태학, 및 생리학, 각 종은 다른 실험 절차에 다르게 반응합니다. 따라서 시료 준비 중에 가장 적합한 고정 및 염색 시약을 선택하고 각 종에 대해 조정된 각 단계에서 조건을 설정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 각 샘플에 대해 장착 방법, 전압, 전류, 기계적 확대 속도 및 공간 분해 전력과 같은 스캐닝 구성을 적절히 설정해야 합니다. 이 문제를 극복하기 위해 필요한 모든 단계를 포괄하는 간단하고 이해하기 좋은 매뉴얼을 통해 각 단계가 시편에 따라 어떻게 조정할 수 있는지 설명하고 여러 샘플의 자세한 예제를 보여 주는 것이 필수적입니다.

본 연구에서는, 우리는 3개의 해양 무척추 동물 종을 사용하여, 견본 고정에서 데이터 분석에 마이크로CT 화상 진찰 프로토콜을 단계별로 기술합니다. 도내 미사키 해양 생물국 근처에서 말미잘 액티니아 에퀴나(안토조아, Cnidaria)의 표본을 수집하였다. 그들은 직경이 약 2cm인 구형의 부드러운 몸을 가지고 있었다 (그림1A-C). 하모토 스프(폴리채타, 안넬리다) 시료도 미사키 해양 생물국 근처에서 채취하였다. 길이가 약 1.5cm인 가느다란 벌레였고, 몸 전체를 따라 터프한 채태가 존재한다(그림1D). 제13회 JAMBIO 해안 생물 공동 조사 에서 쓰쿠바 대학 시모다 해양 연구 센터 근처에서 Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) 표본을 수집했습니다. 길이가 0.8cm에 달하는 부드러운 몸의 벌레였다(그림1E). 각 샘플의 조건 및 구성에 대한 조정에 대해 자세히 설명합니다. 우리의 연구 결과는 해양 무척추 동물에 microCT 화상 진찰을 능력을 발휘하는 방법에 대한 몇몇 제안을 제공하고, 우리는 생물학자가 그들의 연구를 위해 이 프로토콜을 이용하도록 격려할 것이라는 점을 희망합니다.

Protocol

1. 고정 액티니아 에퀴나에대해, 실온에서 약 15분 동안 10% MgCl2 바닷물에서 동물을 이완시. 70% 에탄올로 옮기고 실온에서 보관하십시오. Harmothoe sp.의 경우, 동물을 얼음차가운 바닷물에 약 15 분 동안 넣어 마취하십시오. Xenoturbella japonica의경우, 담수에서 7% MgCl 2를 사용하여 동물을 이완시하십시오. 하룻밤 여과 된 바닷물에 4 % 파라 포름 ?…

Representative Results

우리는 A. equina (안토조아, Cnidaria), 하모토 스p. (폴리채타, 안넬리다) 및 X. 자포니카 (Xenoturbellida, 제나코엘로모파)에서 25 % 루골 용액으로 샘플을 염색 한 후 마이크로 CT 이미징을 수행했습니다. 염색은 성공적으로 내부 연조직의 관찰을 가능하게, 모든 견본에 있는 내부 구조물의대조를 향상했습니다 (그림 6). 과거의 보고서와 함께6…

Discussion

본 연구에 사용된 해수에서 10% (v/v) 포르말린 용액과 같은 포르말린을 이용한 고착제는 다양한 해양 무척추 동물의 형태를 보존하는 것으로 알려져 있으며 마이크로CT 이미징18,24,25에 자주 사용됩니다. ,26,28,30,33. 그러나, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

시로이시 도시히코씨의 도움과 연구 환경 제공에 감사드립니다. 야나기 켄스케와 이즈미 다카토에게 A. 에퀴나,다나카 마사츠에 대한 조언을 해주신 것에 감사드립니다. 시모다 해양연구센터, 츠쿠바대학, 미사키 해양생물국, 도쿄대학 의 시모다 해양생물센터 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다. 이 작품은 젊은 과학자를위한 JSPS 보조금 에이드 (A) (JP26711022)와 JAMBIO, 일본 해양 생물학 협회에 의해 지원되었습니다.

Materials

250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105
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References

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Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).
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