Summary

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

Published: March 07, 2019
doi:

Summary

이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

Abstract

산화 또는 호흡기 버스트는 다양 한 면역 자극에 응답 식 세포에 의해 산소의 급속 한 소비와 반응성 산소 종 (ROS)의 발생을 설명 하기 위해 사용 됩니다. 선생님 면역 활성화 중 생성 된 미생물의 죽음을 일으키는 주로 손상 DNA와 단백질, 선생님의 능력을 통해 강력한 항균 활성을 발휘 한다. Reproducibly 고 쉽게 선생님 생산을 측정할 수 있는 다양 한 경로 호스트 방어의이 메커니즘을 분자의 기여를 평가 하기 위해 필요 하다. 이 종이에 우리 형광 프로브의 사용과 cytometry 선생님 생산 검색 합니다. 널리 사용 되지만, 선생님의 형광 측정 특정 하지 mitogenic 자극에 의해 유도 된 선생님의 측정에 관하여 특히 악명 높게 문제 이다. 우리는 대 식 세포 생성, 못쓰게, 얼룩, FcγR 교차 연결, 및 결말 흐름 cytometric 분석 시작 특정 FcγR 자극 결과로 생성 된 선생님을 감지 하는 상세한 방법론 제시.

Introduction

반응성 산소 종 (선생님)는 반응 분자 또는 호 기성 호흡 ( 1에서검토)의 부산물입니다 자유 래 디 칼. Superoxide 음이온, 과산화 수소, 과산화 수소, 수 산 기 과격 한, 그리고 수 산 기 이온, 다른 사람의 사이에서 포함 됩니다. 정상적인 생리 적인 조건 하에서 선생님 미토 콘 드리 아와 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NADPH) oxidases에 의해 주로 생성 하 고 다양 한 효소와 단백질 superoxide dismutase, glutathione 등 여 detoxified 빠르게. 선생님 또는 선생님을 제거 하는 기능에 결함의 과장 된 생산 산화 스트레스, 반응성 산소 종 단백질, 지질, 및 세포 스트레스 또는 죽음 및 병 적인 질병 상태를 선도 하는 DNA의 손상을 촉진 하는 그것에 의하여 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 현재 감사 선생님 수 있습니다. 신호 분자 (산화 환 원 신호), 또한 역할을 하 고 다양 한 분자 및 통로 중간체의 수정 선생님 중재 세포질 물질 대사, 증식, 생존, 선 동적인 영향을 미칠 수 있습니다. 신호, 그리고2노화입니다. Phagocytic 세포에서 선생님 소위 “호흡 파열”1,,34,,56동안 항균 성 활동을 제공 하는 필수적인 역할을 재생 합니다. 식 세포의 외부 자극에 응답, 동안에 NADPH 산화 효소 복잡 한 (p40phox, p47phox, p67phox)의 구성 요소 포함 하는 gp91phox 및 p22phox phagosomal 막에는 cytosol에서 이동 소 단위, 완전 하 게 작동 NADPH 산화 효소 효소 복잡 한 형성 Rac1/2의 작업을 함께. 조립된 NADPH 산화 효소는 다음 NADPH 산소 phagosomal 공포 시간 초과를 줄이기 위해 활용 합니다. Superoxide 음이온 직접 손상 될 수 있습니다 또는 과산화 수소에 dismutated. 초과 과산화 수소는 반응성이 매우 높은 수 산 기 급진 파를 생성 하는 다른 분자와 반응 수 있습니다. 손상 또는 제한 된 미생물 물질 대사 또는 미생물5의 죽음을 선도 하는 궁극적으로 DNA의 기본 산화를 발생 하 여 철-황 단백질에 클러스터와이 선생님의 반응에 의해 중재 됩니다. 복잡 한 NADPH 산화 효소 효소의 중요성 및 호흡기 버스트 동안 생산 하는 선생님은 삽화가 임상 환자 만성 Granulomatous 질병 (CGD)7,,89, 10. CGD와 개인 소유 gp91phox에서 돌연변이 선생님 생산 및 박테리아와 균 류는 보통 immunocompetent 개인 관심사는 재발 감염 민감성의 부족의 결과. 따라서, 공부 하는 산화 스트레스, 산화 환 원 신호, 또는 호스트 방어 되 고 측정할 수 있는지 여부를 실시간으로 선생님 생산 유용한 노력 이다.

여러 분석 실험 측정 선생님 생산 또는 산화 스트레스11,,1213의 결과 이용 되어 있다. 이러한 가운데, 중 가장 널리 사용 되는 형광 프로브 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-다)14. 이 분자는 무색이 고 질 성. DCFH2-다 세포 막에 걸쳐 확산이 있습니다 세포내 esterases에 의해 위에 행동 될 DCFH2, 스며들 지 않는 셀 렌더링으로 deacetylates는. 선생님 (과산화 수소, peroxynitrite, 수 산 기 유리 기, 산화 질소 및 peroxy 급진 파) DCFH2 에 여러 종류의 작업은 형광 DCF로 산화 (전 보고 / Em: 485-500 nm/515-530 nm)는 흐름을 사용 하 여 감지할 수 있습니다 cytometer fluorescein (FL1 채널)에 대 한 설정 하는 표준 필터 장착. Superoxide는 DCFH2 와 강하게 반응 하지 않습니다 하지만 다른 프로브 dihydroethidium (DHE) 형광 제품 2-hydroxyethidium (뿐만 아니라 다른 형광 superoxide 독립적인 산화 제품)15를 반응 수 있습니다. DHE 산화의 형광 제품 518의 여기 파장을 사용 하 여 검출 될 수 있다 및 605의 방출 파장 nm (FL2 채널). 하지만 비교적 사용이 간단, 선생님의 검출에 대 한 이러한 프로브 활용 그들의 한계의 지식 및 얼룩이 지기의 절차 및 컨트롤에 유효한 있기 위하여 수행 되 고 특정 분석 결과 실험 주의 설립 필요 합니다. 결과 및 결론입니다. 다음 프로토콜 채용이 2 프로브 cytometry 여 선생님을 측정 하도록 설계 되어 상용 키트의 사용을 보여줍니다. 우리는 이러한 프로브 끝났다 골 수 유래 세포를 얼룩이 고 FcγR cross-linking 통해 선생님 생산 유도. 우리는이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 데이터 제시 하 고 성공적인 실험을 위해 착수 해야 하는 적절 한 예방 조치를 강조.

Protocol

처리 하는 동물에 대 한 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 센트럴 플로리다 대학의에 의해 승인 되었다. 1. 골 수의 생성 유래 세포 (BMDMs) 문화 미디어 준비 D10F 기본 미디어 준비:에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 추가 10% 열 소 태아 혈 청 (FBS), 1 m m 나트륨 pyruvate, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 산과 0.05 m m β-mercaptoethanol…

Representative Results

내에서 설명 된 프로토콜을 사용 하는 FcγR 통해 WT C57BL/6J BMDMs의 자극에서 발생 하는 선생님 생산의 흐름 cytometric 탐지를 보여주는 대표적인 데이터 선물이. 예상 대로, 우리 unstimulated 셀에 배경 수준 이상의 FL1 또는 FL2 형광에서 최소한의 변화 관찰 (그림 3A, “스테인드, unstimulated” vs “흠 없는, unstimulated” 점 플롯 비교). 우리는 셀 FcγR cross-linking 대리인 (그림 3A</…

Discussion

DCFH2-다 고 선생님의 DHE 기반 탐지 기술은 널리 사용14,15입니다. 사용의 용이성과 이러한 선생님 프로브 키네틱 microplate 형식에 대 한 적응성, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometric 분석은 그들의 인기에 기여 했다. 그러나, 우리의 연구에서 FcγR 중재 하는 대 식 세포 기능, 거기 보이지 않았다 될 FcγR 상호 연결 된 셀의 흐름 cytometric 분석을 위?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 Madelyn H. 밀러, 등 오마르 카 르도 나, Andjie Jeudy, Roopin 싱 실험실 유지와 마우스 식민지 유지 관리에 그들의 도움에 대 한 Tigno-아 랑 페 즈 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 연구에 대 한 지원 그랜트 R00 HL122365와 J.T.T-a 시작 자금에 의해 제공 된

Materials

Anti-BSA IgG1 Innovative Research IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400626
Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 BD Biosciences 565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC BioLegend 123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647  BioLegend 101218
beta-mercaptoethanol (BME) Sigma M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV Fisher BP1600-100
C57BL/6J  Jackson labs Stock No.000664
CM-H2DCFDA Molecular Probes C6827 Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE) Molecular Probes D11347 Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x Corning 10-013-CV
DMEM no phenol red Gibco 31053-028
DMF Anhydrous  Acros Organics 61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody BioLegend 400506
HEPES (1M) Gibco 15630-080
L glutamine Gibco 25030-081
LADMAC cells ATCC CRL-2420
MEM Corning 10-010-CV
mouse IFN-g GoldBio 1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine EMD Milipore 106425 Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler Acea 2060R
Pyocyanin (ROS inducer) Cayman chemical 10009594 Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit ENZO ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM) Gibco 11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056

References

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
  7. Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
  8. Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
  9. Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
  10. Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
  11. Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
  12. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
  15. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  16. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).

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Cite This Article
Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J. Vis. Exp. (145), e59167, doi:10.3791/59167 (2019).

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