Измерение расхода гранулярных производства рос в макрофагах в ответ на FcγR сшивки
Summary
Это исследование демонстрирует использование проточной цитометрии для обнаружения реактивнооксигенных видов (ров) производства в результате активации FcγR. Этот метод может использоваться для оценки изменений в противомикробные и сигнальные функции фагоцитов в ответ иммунные комплексы, опсонизированными микроорганизмов или прямого FcγR cross-linking окислительно-восстановительные.
Abstract
Окислительная или дыхательных всплеск используется для описания быстрого потребления кислорода и поколение реактивнооксигенных видов (ров), фагоциты в ответ на различные стимулы иммунной. ROS, созданные во время иммунной активации оказывает мощный антимикробной активности, главным образом через Рось возможность повреждения ДНК и белков, вызывает гибель микроорганизмов. Будучи в состоянии измерить ROS производства можно воспроизвести и с легкостью необходимо для того, чтобы оценить вклад различных путей и молекул, чтобы этот механизм узла обороны. В этой статье мы продемонстрировать использование флуоресцентных зондов и проточная цитометрия обнаружить производства рос. Хотя широко используется, флуоресцентный измерение ROS крайне проблематичным, особенно в том, что касается измерения ROS, вызванных конкретными и не митогенный раздражителей. Мы представляем подробная методология для обнаружения рос в результате конкретных FcγR стимуляции, начиная с поколения макрофагов, грунтование, окрашивание, FcγR cross-linking и заканчивая гранулярных анализа потока.
Introduction
Реактивнооксигенных видов (ров), реактивных молекул или свободные радикалы, которые являются побочными продуктами аэробного дыхания (обзор в 1). К ним относятся супероксид анион, пероксид, перекись водорода, Гидроксильная группа и гидроксильных ионов, среди других. В нормальных физиологических условиях Рось производятся главным образом в митохондриях и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы и быстро обезвреженных различными ферментов и белков, таких как супероксиддисмутазы и глутатиона. Преувеличенные производства ROS или дефект в возможность удалять ROS может привести к окислительный стресс, whereby реактивнооксигенных видов содействия ущерб белки, липиды и ДНК, ведущих к клеточного стресса или государств патологических заболеваний и смерти. Однако она в настоящее время ценится, что рос может также выступать в качестве сигнальных молекул (редокс сигнализации), и рос опосредованной модификации различных молекул и промежуточных путь может влиять клеточный метаболизм, распространения, выживание, воспалительные сигнализации и старения2. Фагоцитирующих клеток Рось играет важную роль в предоставлении антимикробной активности во время так называемого «дыхательных взрыв»1,3,4,5,6. Во время реакции на внешние раздражители, фагоциты перемещают компоненты NADPH оксидаза комплекс (p40phox,phoxp47 p67phox) от цитозоль phagosomal мембраны, содержащий gp91phox и p22phox подразделения, и вместе с действиями Rac1/2, формируют полностью функциональный NADPH оксидаза ферментного комплекса. Затем собранный NADPH оксидаза использует NADPH сократить кислорода до супероксида в пределах phagosomal вакуоль. Супероксид анионов непосредственно может привести к повреждению или dismutated в перекиси водорода. Супероксиддисмутаза и перекись водорода может реагировать с другими молекулами для создания высокой реакционной способностью гидроксильных радикалов. Повреждение опосредовано реакции этих рос с железо серные кластеры на белки или вызывая базовый окисления ДНК, в конечном счете приводит к ограниченным микробного метаболизма или смерти Микроб5. Важность NADPH оксидаза ферментного комплекса и ROS, вырабатываемые в ходе дыхания всплеск иллюстрируется клинически у больных с хроническим гранулематозная болезнь (КГД)7,8,9, 10. лица с CGD имеют мутации в gp91phox, что приводит к отсутствию производства рос и восприимчивость к инфекции с бактериями и грибками, которые обычно не являются проблемой с иммунокомпетентных лиц. Таким образом изучения оксидативного стресса, редокс сигнализации или принимающей обороны, возможность измерить ROS производства в режиме реального времени является ли полезные усилия.
Несколько анализов были использованы для производства рос меру или результаты оксидативного стресса11,12,13. Среди них одной из наиболее широко используемым является флуоресцентный зонд 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein диацетата (DCFH2-DA)14. Эта молекула является бесцветным и липофильных. Распространение DCFH2-да через клеточную мембрану позволяет быть приняты внутриклеточных эстераз, который deacetylates в DCFH2, визуализации ячейки непроницаемыми. Действия нескольких типов Рось (перекись водорода, пероксинитрита, гидроксильных радикалов, оксид азота и перокси радикалы) на DCFH2 окислить его в DCF, который флуоресцентные (сообщил Ex / Em: 485-500 Нм/515-530 Нм) и может быть обнаружен с помощью потока цитометр оснащены стандартным фильтром Набор для флюоресцеином (значения параметров FL1 канал). Супероксид не сильно реагируют с DCFH2 , но может реагировать с другой зонд dihydroethidium (DHE) приносить флуоресцентные продукт 2-hydroxyethidium (а также других продуктов флуоресцентные супероксид независимые окисления)15. Флуоресцентный продуктов окисления DHE могут быть обнаружены с помощью волны возбуждения 518 Нм и длина волны излучения 605 Нм (FL2 канал). Хотя сравнительно прост в использовании, использование этих датчиков для обнаружения ROS требует знания их ограничений и тщательного включения окрашивания процедур и механизмов контроля в конкретных assay, выполняемой для того чтобы иметь действительный экспериментальной результаты и выводы. Следующий протокол демонстрирует использование коммерчески доступных комплект, используя эти 2 зонды, разработанный для измерения ROS проточной цитометрии. Мы пятно загрунтовать макрофагов, костного мозга, полученных этими датчиками и заставить ROS производства через FcγR сшивки. Мы представляем репрезентативных данных, полученных с помощью этого протокола и подчеркнуть соответствующие меры предосторожности, которые должны быть предприняты для успешного проведения экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-да и на основе DHE обнаружения рос является широко используется техника14,15. Простота использования и адаптации этих ROS зонды для кинетического Гонав форматов, флуоресцентной микроскопии или потока гранулярных анализа способствовала их популярн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить других членов Tigno-Аранхуэс лаборатории, включая Madelyn Миллер, Омар Кардона, Andjie Jeudy и Roopin Сингха за их помощь в лабораторной мыши и ведением колонии обслуживания. Была оказана поддержка для этого исследования Грант R00 HL122365 и начальных средств для J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
