巨噬细胞 ros 产生的流式细胞仪测量对 fcγr 交联的响应
Summary
这项研究表明, 使用流式细胞仪检测活性氧 (ros) 的产生, 由于激活的 fcγr。该方法可用于评估吞噬细胞对免疫复合物、光化微生物或直接 fcγr 交联的抗菌和氧化还原信号功能的变化。
Abstract
氧化或呼吸爆裂是用来描述快速消耗氧气和产生活性氧物种 (ros) 的吞噬细胞响应各种免疫刺激。免疫激活过程中产生的 ros 主要通过 ros 破坏 dna 和蛋白质的能力来发挥有效的抗菌活性, 从而导致微生物死亡。能够可重复地、轻松地测量 ros 的生产是必要的, 以评估各种途径和分子对这种宿主防御机制的贡献。本文演示了荧光探针和流式细胞仪在检测 ros 生产中的应用。虽然广泛使用, 荧光测量 ros 是出了名的问题, 特别是在测量 ros 引起的特定和非有丝分裂的刺激。我们提出了一个详细的方法来检测 rs 产生的特定 fcγr 刺激的结果, 从巨噬细胞的产生, 启动, 染色, fcγr 交联, 并结束与流式细胞仪分析结束。
Introduction
活性氧 (ros) 是活性分子或自由基, 是有氧呼吸的副产品 (综述在 1)。其中包括超氧化物阴离子、过氧化物、过氧化氢、羟基自由基和羟基离子等。在正常的生理条件下, ros 主要由线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nadph) 氧化酶产生, 并由超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等多种酶和蛋白质快速解毒。ros 的夸大产生或去除 ros 能力的缺陷会导致氧化应激, 其中活性氧物种会促进蛋白质、脂质和 dna 的损害, 导致细胞应激或死亡和病理疾病状态。然而, 目前人们认识到 ros 也可以作为信号分子 (氧化还原信号), 而 ros 介导的各种分子和途径中间体的修饰可以影响细胞代谢、增殖、生存、炎症信号, 和老化2。在吞噬细胞中, ros 在提供所谓的 “呼吸爆裂”1、3、4、5、6期间发挥着至关重要的作用。在吞噬细胞对外部刺激的反应中, nadph 氧化酶复合物 (p40 phox、p40phox、p40phox) 的成分从细胞溶胶转移到含有 gp91 phox 和 p22phox 的吞噬膜上亚基, 并与 rac半的行动, 形成一个全功能的 nadph 氧化酶复合物。然后, 组装的 nadph 氧化酶利用 nadph 将氧气还原为脂肪体液泡内的超氧化物。超氧化物阴离子可直接造成损害或分解成过氧化氢。超氧化物和过氧化氢都可以与其他分子发生反应, 产生高活性的羟基自由基。损伤是由这些 ros 与蛋白质上的铁硫簇反应或导致 dna 的碱基氧化来介导的, 最终导致微生物代谢受限或微生物5死亡。在慢性肉芽肿病 (cgd)7, 8, 9,10. 患有 cgd 的个体在 gp91phox 中具有突变, 导致缺乏 ros 的产生, 并容易受到细菌和真菌的反复感染, 而细菌和真菌通常与免疫能力的个人无关。因此, 无论是研究氧化应激、氧化还原信号, 还是宿主防御, 能够实时测量 ros 的产生都是一个有益的尝试。
多项检测已被用来测量 ros 的产生或氧化应激的结果 11,12,13。其中, 其中最广泛使用的是荧光探针 2 ‘, 7 ‘ 二氯氢荧光素二乙酸 (dcfh 2-da)14.这种分子是无色和亲脂性的。dcfh-da 在细胞膜上的扩散使其能够通过细胞内酯酶作用, 从而将其转化为 dcfh2 , 使其具有不渗透性。多种类型的 ros (过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮和过氧自由基) 在 dcfh2上的作用将其氧化为荧光的 dcf (报告为 exsem:485-500 nm\ 15-530 nm), 并可通过流量检测细胞仪配备了荧光素 (fl1 通道) 的标准过滤器集。超氧化物与 dcfh2 不强烈反应, 但可与另一种探针二氢乙二酸 (dfe) 反应, 产生荧光产物 2-羟基乙酸 (以及其他与荧光超氧化物无关的氧化产物)15.使用518纳米的激发波长和 605 nm (fl2 通道) 的发射波长可以检测到 dfe 氧化的荧光产物。虽然使用起来相对简单, 但要利用这些探针检测 ros, 需要了解它们的局限性, 并仔细地将染色程序和控制纳入正在进行的具体检测中, 以便有有效的实验结果和结论。下面的协议演示了使用商用套件的方法, 该套件采用了这两个探头, 用于流式细胞仪测量 ros。用这些探针染色引种骨骨髓衍生的巨噬细胞, 通过 fcγr 交联诱导 ros 的产生。我们提供了使用该协议获得的具有代表性的数据, 并强调了成功试验必须采取的适当预防措施。
Protocol
Representative Results
Discussion
dcfh 2-da 和基于 dhes 的 ros 检测是一种广泛使用的技术14,15.这些 ros 探针在动力学微板格式、荧光显微镜或流式细胞仪分析中的易用性和适应性有助于其普及。然而, 在我们对 fcγr 介导的巨噬细胞功能的研究中, 似乎没有一个标准的方法来进行 fcγr 交联细胞的流式细胞仪分析。鉴于所评估的分析物的反应性, 我们发现时间安排对于确保实现重现性?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢 tigno-aranjuez 实验室的其他成员, 包括 madelyn h. miller、omar cardona、andjie jeudy 和 roopin singh, 感谢他们在实验室维护和老鼠群体维护方面提供的帮助。这项研究的支助是由 r00 hl122365 赠款和 j. t. t. a. 启动资金提供的。
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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