İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı
Summary
Transgenik lck:eGFP Zebra balığı GFP son derece T lenfosit hızlı ve T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi çalışmaya kullanılmıştır. Bu satırı lck daha alt düzeylerde hızlı çalışma B hücreleri için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı arıtma lck:eGFP Zebra balığı kötü huylu ve kötü huylu olmayan B hücre açıklar.
Abstract
Zebra balığı (Danio rerio) lenfosit geliştirme eğitim için güçlü bir model vardır. Memeliler gibi D. rerio B ve T lenfositleri içeren bir adaptif bağışıklık sisteminin sahip. D. rerio hücre yüzey işaretleyicileri tanıma antikorlar genellikle yalıtım ve karakterizasyonu B lineage dahil olmak üzere farklı lenfosit nüfusun karmaşık hale getiren, olmaması nedeniyle Zebra balığı lymphopoiesis çalışmaları zor hücreleri. Transgenik satırları lineage özgü fluorophore ifade ile sık sık bu zorluğu aşmak için kullanılır. Transgenik lck:eGFP satırı D. rerio T hücre gelişimini incelemek için kullanılan ve aynı zamanda modeli T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) kullanıldığında vardır. LCK:eGFP balık yaygın olarak T-lineage çözümlemek için kullanılan olsa da, bunlar B hücreleri çalışmaya kullanılmıştır değil. Son zamanlarda, birçok Zebra balığı B hücreleri de lck, hızlı da olsa daha alt düzeylerde keşfettik. Sonuç olarak, lck:eGFP B hücreleri aynı şekilde GFP seviyesinin düşük hızlı. Bu bulgu üzerinde bağlı olarak, biz burada rapor lck:eGFP Zebra balığı B lineage hücrelerden arındırmak için bir protokol geliştirdik. Bizim yöntem lck:eGFP balık veya çift transgenik rag2:hMYCgibi ilgili satırları B hücreleri arındırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) kullanmak açıklar; LCK:eGFP balık. Bu satırları, B hücreleri, özellikle olgunlaşmamış B hücreleri, düşük ama algılanabilir seviyede hızlı GFP GFP son derece hızlı T hücrelerden ayırt edici olmalarını sağlar. B hücreleri kemik iliği, timus, dalak, kan veya diğer dokularda ayrılmış olabilir. Bu iletişim kuralı D. rerio B hücreleri, B hücre gelişimi ve B lenfosit maligniteler gibi konular üzerinde duruldu çalışmalar etkinleştirme arındırmak için yeni bir yöntem sağlar.
Introduction
Zebra balığı genetik yaklaşımlar kullanarak eğitim omurgalı geliştirme kolaylaştırmak güçlü öznitelikleri genetik manipulability, yüksek verimlilik, optik kalınlığı ve hızlı bir gelişme gibi sunuyoruz. Teleost ve memeli hematopoiesis, paylaşılan özellikleri ile birlikte bu avantajları D. rerio larva yetişkinlik boyunca erken kendi görünümünü gelen lymphopoiesis ve lenfosit fonksiyon içinde vivo analizleri için ideal kılar. Zebra balığı kan geliştirme memeliler ile paylaşılan iyi korunmuş genetik işlemleri üzerine dayanır ve bunlar edinilmiş bağışıklık sistemi genişletmek. Ayrıca, moleküler mekanizmaları lenfoid geliştirme yöneten Zebra balığı ve memeliler1arasında son derece korunmuş.
Son 2 yılda bu etiket belirli kan soy transgenik D. rerio hatları ve mutant satırları bu soy eksik2,3,4,5oluşturulmuştur. Bunlardan lck:eGFP transgenik hattı, Zebra balığı lenfosit protein tirozin kinaz (lck) organizatörü GFP ifade6sürücü için kullanır. Çok T-lineage öncüleri ve Olgun T lenfositler tarafından ifade edilir, bu gen içinde vivo timik T hücre gelişimi ve ex vivo arıtma T-lineage hücre FACS7tarafından izleme sağlar. Daha önce biz bu hat bir ileri genetik trk mutagenesis ekran germline mutantlar T-ALL için eğilimli tanımlamak ve genetik olaylar somatically satın T hücre oncogenesis8,9‘ a bağlı çalışma için kullanılır.
Son zamanlarda, bizim laboratuvar lck:eGFP Zebra balığı yardımcı programı daha da genişletilmiş. Çift-transgenik rag2:hMYC içinde (insan MYC), T-ALL 10, geliştirmek için bilinen lck:eGFP ö rerio keşfettiğimiz B lineage tüm da11oluşur. B-tüm loş floresan T-ALL parlak yüksek GFP ifade nedeniyle belli, bu modelde aksine düşük GFP düzeyleri nedeniyle balık fena halde üzerinden bu T-ALL ile floresan mikroskopi tarafından ayırt edici olması için B-ALL ile izin. Bu fark GFP ifade de GFPlo B-tüm hücreleri ayrılması GFPMerhaba –dan T-tüm hücreleri FACS11kullanarak verir. Ayrıca, düşük lck ifade insan B-tüm Ayrıca hızlı düşük seviyelerde LCK11,12B-ALL, Zebra balığı benzersiz değildir. Aynı şekilde, normal B lineage hücreleri D. rerio, fareler ve insanlar da lckseviyesinin düşük hızlı /Lck/LCK, olgunlaşmamış B hücreleri ile sahip en yüksek ifade11,13. Hücre başına bazında, B-lineage hücreleri lckeGFP Zebra balığı veya türev satırı % 1-10 kadar GFP T lenfositler ifade. Bu GFPlo hızlı karakteristik B hücre mRNA’ların pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzve diğerleri gibi hücreleri ve kemik iliği, timus, dalak veya periferik saf kan11. Bu nedenle, her iki B – ve T-hücreler olabilir soy lckeGFP Zebra balığı ve rag2hMYC, lckeGFP hayvanlar, B ve T tüm hücreleri de söz konusu olduğunda11izole.
Burada, bizim iletişim kuralı lck:eGFP Zebra balığı ve rag2hMYC-kötü huylu veya kötü huylu B hücrelerinin verimli bir şekilde FACS arındırmak Malign B hücreleri için mevcut; lck:eGFP balık, çeşitli kaynak dokuları kullanarak. Bu hücreler aynı şekilde Akış Sitometresi FACS yalıtım, olmadan tarafından istenirse sayısal. Düşük lck ifade keşfi- ve sonuç olarak, GFP ifade düşük-B tarafından hücreleri açar yeni kapılar için lckeGFP Zebra balığı, deneysel olanaklar içinde vivo B hücre gelişim çalışmaları gibi. Böylece, transgenik bu içini kaplamak, 2004’te, ilk rapor kullanmak o Zebra balığı edinilmiş bağışıklığın ile ilgili taze anlayışlar seçip ayırmak için aramak gibi yeni bir hayat var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz gelişmiş ve bu B-lineage etiketleri3,4ile diğer D. rerio modeller ekleme lck:eGFP transgenik Zebra balığı, B hücreleri izole etmek için bir protokol sağlar. Biraz şaşırtıcı, GFPlo B hücreleri bu satırdaki tanımlaması açıklamasını 2004 yılında beri gözden kaçmış gitmiş. Genel olarak, lck T hücre özgü6olarak kabul edilir, ama beklenmedik lck ifade doğal öld?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Megan Malone-Perez Zebra balığı Bakımı ve OUHSC Akış Sitometresi çekirdek teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Hyundai umut gezici, Oklahoma Merkezi bilim ilerleme ve Teknoloji (HRP-067), bir NIH/NIGMS INBRE pilot proje Ödülü (P20 GM103447) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. JKF E.L. & Thelma Gaylord donatılmış sandalye pediatrik hematoloji-Onkoloji, Çocuk Hastanesi Vakfı’nın tutar.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
