Fastsættelsen af den æg befrugtning Bemisia tabaci ved hjælp af en cytogenetisk teknik
Summary
Vi præsenterer en enkel cytogenetisk teknik bruger 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til at bestemme den befrugtning og primære kønsfordelingen af haplodiploid invasive skadedyr Bemisia tabaci.
Abstract
Et par arter af sap-sugende whiteflies er nogle af de mest skadelige jordbaserede skadedyr på verdensplan på grund af den afgrøde skader de påføre og plant vira de vektor. Trods talrige undersøgelser af biologi af disse arter i forskellige miljøer, en nøgle livshistorie parameter, afkom sex nøgletal, har modtaget megen opmærksomhed, endnu er vigtig for at forudsige populationsdynamik. Den primære kønsfordelingen (kønsfordelingen på oviposition) af Bemisia tabaci er aldrig blevet rapporteret men kan findes ved fastsættelsen af æg befrugtning sats af denne haplodiploid insekt. Teknikken indebærer dechorionation af æg med blegemiddel, en række fiksering trin og anvendelsen af den generelle DNA fluorescerende plet, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, en DNA-bindende fluorescerende farvestof), binde til kvindelige og mandlige pronuclei. Vi præsenterer her, teknikken, og et eksempel på dets anvendelse, at teste, om en endosymbiotiske bakterie, Rickettsia sp. nr. bellii, påvirket den primære kønsfordelingen af B. tabaci. Denne metode kan hjælpe i befolkningen undersøgelser af whiteflies, eller bestemme, hvis sex tildeling findes med visse miljømæssige stimuli.
Introduction
Studiet af sex tildelingen, eller den relative investering i mandlige og kvindelige afkom, er en hjørnesten i adfærdsmæssige økologi1,2,3. Ud over sin magt til test adaptive modeller af adfærd, kan at kende sex strategien i en organisme forbedre modeller af sit populationsdynamikken. I mange arter styres sex tildeling af mødre. For at fastslå køn tildeling, er det vigtigt at bestemme de primære kønsfordelingen eller andelen af hunner samtidig med ægget deposition. Selv om kønsfordelingen på voksen opståen kan give et fingerpeg til sex tildeling, kan differential udviklingsmæssige dødelighed mellem mandlige og kvindelige ungfisk almindeligvis skew adult sex forholdet betydeligt. I nogle arter af hvepse, rækkefølgen af insekter, der indeholder myrer, bier og hvepse, er den primære kønsfordelingen fastslået med cytogenetisk assays, farvning af embryoner for at se genetisk DNA. Fordi hymenopterans er haplodiploid, en begyndende mandlige æg er haploide og indeholder kun de kvindelige pronucleus (n), mens begyndende kvindelige æg er diploide og indeholder både mandlige og kvindelige pronuclei (2n). Selvom Aleyrodidae, familien sap-fodring af hemiptera (Hemiptera) kendt som whiteflies, er også haplodiploid, har der ikke været en etableret analyse til at finde den primære kønsfordeling i disse insekter. Det er måske overraskende, da intensiteten af undersøgelse af de par kosmopolitiske alvorlige skadedyr i denne familie og betydningen af køn nøgletal i konkurrencedygtige interaktioner i whiteflies4,5,6,7 ,8,9,10 og i populationsdynamikken generelt. I haplodiploid insekter også er sex nøgletal ugenert af sex bestemmelse systemer, så muligheden for selektiv befrugtning og labile sex nøgletal, der varierer med miljø2. Her præsenterer vi en teknik til at bestemme de primære kønsfordelingen af arter kompleks af whiteflies kendt kollektivt som sweetpotato whitefly, B. tabaci. Denne én art navn omfatter mere end 28 arter på verdensplan11og omfatter nogle af de mest skadelige globale invasive skadedyr12,13. Anvendelse af denne teknik til at bestemme sex tildeling mønstre i B. tabaci og andre Aleyrodidae vil tillade en mere nøje undersøgelse af variabler, herunder temperatur, værten plante, endosymbiotiske bakterier eller plante/whitefly patogener, der kan påvirke whitefly primære sex nøgletal og whitefly populationsdynamik.
Vi er uvidende om nogen sammenlignelige æg-farvning teknikker til B. tabaci. Protokollen er bekvemt i forhold til farvning metoder anvendes til andre insekt æg14 som det udelader en overnight fiksering skridt, og derfor kan afsluttes inden for 3 h. Som et eksempel på et program, en endosymbiotiske bakterie, Rickettsia sp. nr. bellii, er forbundet med kvindelige fordomme i vores laboratorium linjer af B. tabaci Mellemøsten og Asien mindre 1 (MEAM1)15,16. I én B. tabaci MEAM1 laboratorium linje (“MAC1,” indsamlet fra Maricopa landbrugs Center), vi tester om Rickettsia-inficerede (R+) hunnen befrugte flere æg end ikke-inficerede (R–) kvinder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er først til at fange befrugtning sats eller primære kønsfordelingen af B. tabaci. Udfordringen i denne protokol er, at det kræver forskere til at lære at håndtere whitefly æg hurtigt, at sikre, at ikke mere end 1 time er gået siden æggene var oviposited indtil de er faste. Ved indledende forsøg var æg, der blev fastsat til 3 h eller mere postoviposition for gammel til at observere befrugtning, som syngamy havde fundet sted og mitotiske divisioner var undervejs. Mellem 1 til 3 h tog pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er finansieret af en NSF grant (DEB-1020460) til M.S.H. og en USDA AFRI grant (2010-03752) til M.S.H. Forfatterne takke Brennan Zehr for farvning whitefly æg med stor dygtighed og Zen. Forfatterne tak Mike Riehle for at tillade brugen af hans fluorescerende mikroskop til billedbehandling. Forfatterne tak Suzanne Kelly og Marco Gebiola for æg billeder. Forfatterne tak Suzanne Kelly og Jimmy Conway for at hjælpe på afgørende øjeblikke under forsøgene.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
