Summary

細胞遺伝学的手法を用いたタバココナジラミの卵の受精率を決定します。

Published: April 01, 2019
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Summary

4 ′、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 受精率を決定して haplodiploid 侵襲的病害虫タバココナジラミの一次性比を使用して単純な細胞遺伝学的手法を提案します。

Abstract

Sap を吸うコナジラミのいくつかの種は世界の最も有害な地上の害虫の一部を作物損傷、植物ウイルスのベクトルの彼らのためです。異なる環境でこれらの種の生物学の多くの研究にもかかわらず、キーの生活史パラメーター、子孫の性の比率はほとんど注目されて、まだ個体群動態を予測することが重要です。タバココナジラミの一次性比 (産卵性比) ことが報告されているが、この haplodiploid の昆虫の卵の受精率を決定することによって見つけることができます。このテクニックは、漂白剤、一連の固定の手順、一般的な DNA 蛍光染色 DAPI (4 ‘、6-diamidino-2-phenylindole、DNA 結合色素)、女性と男性の前核にバインドするアプリケーションと卵の dechorionation を伴います。ここでは、技法と共生細菌、リケッチアの sp nr かどうかをテストするのには、そのアプリケーションの一例を提案します。bellii、 B. タバココナジラミの一次性比に影響。このメソッドには、コナジラミ、個体群の研究、ある特定の環境の刺激のセックス割り当てが存在する場合を決定するを助けるかもしれない。

Introduction

性配分に関する研究または男性および女性の子孫の相対的な投資行動生態1,2,3の礎石です。行動の適応モデルをテストするため、その力に加え生物のセックス割り当て戦略を知ることがその個体群の動態のモデルを向上します。多くの種で性配分は母親によって制御されます。セックスの割り当てを調べるには、産卵の時に一次性比や女性の割合を決定することが重要です。羽化で性比が性配分への手がかりを提供しますが、男性と女性の稚魚の間発達死亡率差分が大人の性比を大幅に偏る一般的可能性があります。ハチ、アリ、ハチやハチを含む昆虫の順序のいくつかの種の細胞遺伝学的アッセイ、遺伝的 DNA を表示する胚の汚損と一次性比が決定しました。ハエは haplodiploid なので初期オス卵は半数体と初期女性卵は二倍体で、男性と女性の両方前核 (2 n) が含まれている間のみの雌性前核 (n) が含まれています。コナジラミ科、sap 供給族 (半翅目) カメムシ、コナジラミとして知られているがまた haplodiploid、これらの昆虫で主の性比を見つける確立されたアッセイされてはいません。これはおそらく、意外なこの家族にいくつかの国際的な深刻な害虫の研究とコナジラミ4,5,6,7 の競争の相互作用性比の重要性強度を与えられました。 ,8,9,10と個体群動態の一般に。Haplodiploid 昆虫でも、性の比率にとらわれない選択受精と環境2変化する不安定性比の可能性を可能にするセックス定量システム。サツマイモ コナジラミと総称コナジラミの種複合体の主要な性比を把握する手法の紹介B. タバココナジラミ。この 1 つの種名以上 28 種世界11を包含する、最も有害なグローバル侵襲害虫12,13のいくつかが含まれています。B. タバココナジラミと他のコナジラミ科セックス割り当てパターンを決定するためのこの技術の応用は、温度、植物、細胞内共生細菌植物/コナジラミなどの変数のより厳密な調査になります病原体は、コナジラミ一次性比とコナジラミ個体群動態に影響を与える可能性があります。

B. タバココナジラミのための同等の卵染色テクニックと意識しております。プロトコルは、一晩固定ステップを省略し、したがって、3 h 以内に完了することができます他の昆虫の卵14用染色法と比較すると便利です。としてアプリケーション、細胞内共生細菌、リケッチアの sp nr の一例。bellii、 B. タバココナジラミ中東アジア マイナー 1 (MEAM1)15,16の研究室ライン女性のバイアスに関連付けられます。B. タバココナジラミMEAM1 研究室に 1 行で (「MAC1、「マリコパ農業センターから収集) 我々 はテストどうかリケッチアの感染 (R+) 女性 (R) の感染していない女性よりより多くの卵を受精させます。

Protocol

注:室温換気エリアまたはヒューム フードの下ですべての作業を行うことを確認します。このプロトコルのすべて ‘ドロップ’ は、オペレーターの好みに応じて、5-20 μ L として定義されます。 1. 初期設定 きれいな葉のプレハブハウス女性コナジラミを許可します。産卵のアリーナのためクリップ ケージまたはペトリ皿の寒天培地に合うようにカット?…

Representative Results

リケッチア B. タバココナジラミMEAM1 女性の受精率に影響を与えるかどうかをテストするため飼育リケッチア-感染 (R+) または (R-) の感染ササゲ植物 (下におけるササゲ) B. タバココナジラミ27 ° C、相対湿度が 70%、16 h 光/8 h 暗い日長でケージを区切ります。R+と R- 4 齢コナジラミが慎重に葉から削除され…

Discussion

このプロトコル受精率またはB. のタバココナジラミの一次性比をキャプチャする最初のです。このプロトコルへの挑戦はできない以上 1 h は、彼らが修正されるまで、卵が頭から経過したことを確認のコナジラミ卵を迅速に処理する方法について説明する研究者です。予備実験の間に 3 h またはより多くの postoviposition で固定した卵が配偶子が発生するいたし、の分裂が進められていた?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

細胞刺戟する NSF grant (デブ 1020460) 細胞刺戟して米国農務省アフリカ グラント (2010-03752) によって資金が供給されたこの研究著者は、多くのスキルと禅コナジラミ卵の汚損のためブレナン ジョンゼをありがとうございます。著者は、マイク Riehle が彼の蛍光顕微鏡イメージングのための使用を許可することをありがちましょう。著者らは、卵画像スザンヌ ケリーとマルコ Gebiola をありがとうございます。著者は、実験中に重要な瞬間を助けるのためのスザンヌ ケリーとジミー コンウェイをありがとうございます。

Materials

1XPBS Any
1XTBST Any 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water
Bleach Clorox Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite
Clear nail polish Any
DAPI dilactate Santa Cruz Biotechnology sc300415
Ethanol Any Dilute to 70% EtOH
Fluorescent microscope Nikon Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used
Glacial acetic acid Mallinckrodt UN2789
Glycerol Any
Microscope Wild A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used
Microscope slide covers Any Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers.
Microscope slides Any
Minuten nadel pins BioQuip 1208SA Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips
NaCl Any
NaN3 Any
n-propyl-gallate Sigma/Santa Cruz Biotechnology P3130/sc-250794
Parafilm Bemis
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes
PCR grade water Any
Pipette tips Any Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins
Small dropper bulb Any Must fit on Pasteur pipette
Tris Any
Tween-20 Any

References

  1. Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  13. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  14. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  15. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  16. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  17. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  18. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  19. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  20. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  21. Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  22. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  23. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  24. Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

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Cite This Article
Bondy, E. C., Hunter, M. S. Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique. J. Vis. Exp. (146), e59213, doi:10.3791/59213 (2019).

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