Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica
Summary
Vi presentiamo una semplice tecnica citogenetica usando 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per determinare il tasso di fertilizzazione e rapporto primario del sesso del parassita invasivo haplodiploid Bemisia tabaci.
Abstract
Poche specie di aleurodidi sap-succhiare sono alcuni dei più dannosi parassiti terrestri in tutto il mondo a causa i danni alle colture che infliggono e virus vegetali che hanno vector. Nonostante i numerosi studi della biologia di queste specie in ambienti diversi, un parametro chiave vita storia, prole rapporti del sesso, ha ricevuto poca attenzione, è ancora importante per prevedere la dinamica di popolazione. Il rapporto primario del sesso (rapporto del sesso alla deposizione delle uova) di Bemisia tabaci non è stato segnalato mai, ma può essere trovato determinando il tasso di fertilizzazione dell’uovo di questo insetto haplodiploid. La tecnica prevede il dechorionation di uova con candeggina, una serie di passaggi di fissazione e l’applicazione della generale macchia fluorescente DNA, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, una tintura fluorescente DNA-binding), da associare alla pronuclei maschili e femminili. Qui, presentiamo la tecnica e un esempio della sua applicazione, per verificare se un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenzato il rapporto primario del sesso di b. tabaci. Questo metodo può aiutare negli studi di popolazione di aleurodidi, o determinare se allocazione sesso esiste con determinati stimoli ambientali.
Introduction
Lo studio dell’allocazione di sesso, o il relativo investimento nella prole maschio e femmina, è una pietra angolare di ecologia comportamentale1,2,3. Oltre alla sua potenza per test adattivi modelli di comportamento, sapendo che la strategia di allocazione del sesso di un organismo può migliorare modelli delle sue dinamiche di popolazione. In molte specie, allocazione di sesso è controllata dalle madri. Per determinare l’allocazione di sesso, è importante determinare il rapporto primario del sesso o la percentuale di femmine al momento della deposizione dell’uovo. Anche se il rapporto del sesso adulto emersione può fornire indicazioni di attribuzione di sesso, mortalità differenziale dello sviluppo tra i giovani maschi e femminili comunemente comunque alterare il rapporto del sesso adulto sostanzialmente. In alcune specie di imenotteri, l’ordine di insetti che contiene le formiche, API e vespe, il rapporto primario del sesso è stato determinato con analisi citogenetiche, gli embrioni per visualizzare DNA genetico di colorazione. Perché imenotteri sono haplodiploid, un incipiente uovo maschio è aploide e contiene solo il pronucleo femmina (n), mentre incipiente uova femminile sono diploidi e contengono pronuclei maschili e femminili (2n). Anche se Aleyrodidae, la famiglia di insetti Rincoti (Hemiptera) conosciuto come whiteflies, sap-alimentazione sono anche haplodiploid, non c’è un’analisi consolidata per trovare il rapporto primario del sesso in questi insetti. Questo è forse sorprendente dato l’intensità di studio dei pochi parassiti gravi cosmopoliti in questa famiglia e l’importanza dei rapporti del sesso in interazioni concorrenziali di aleurodidi4,5,6,7 ,8,9,10 e in dinamica di popolazione in genere. In haplodiploid insetti troppo, rapporti del sesso non sono vincolati dai sistemi di determinazione del sesso, consentendo la possibilità di fecondazione selettiva e labili rapporti del sesso che variano con l’ ambiente2. Qui presentiamo una tecnica per determinare il rapporto primario del sesso del complesso specie di aleurodidi conosciuti collettivamente come il sweetpotato whitefly, b. tabaci. Questo nome di una specie comprende più di 28 specie in tutto il mondo11e comprende alcuni dei più dannosi parassiti invasivi globale12,13. L’applicazione di questa tecnica per determinare gli schemi di allocazione di sesso in b. tabaci e altri Aleyrodidae permetterà una più rigorosa indagine di variabili, tra cui temperatura, pianta ospite, endosymbiotic batteri o pianta/whitefly agenti patogeni, che possono influenzare whitefly primaria rapporti del sesso e dinamica di popolazione di mosche bianche.
Siamo ignari di qualsiasi tecnica di uovo-macchiatura paragonabile per b. tabaci. Il protocollo è conveniente rispetto ai metodi di colorazione utilizzate per altre uova dell’insetto14 come viene omesso un passaggio di fissazione durante la notte e, di conseguenza, può essere completato in 3 h. Come un esempio di un’applicazione, un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, è associato con bias femminile nelle nostre linee di laboratorio di b. tabaci Medio Oriente-Asia minore 1 (MEAM1)15,16. In una sola riga di laboratorio b. tabaci MEAM1 (“MAC1,” raccolto dalla Maricopa Agricultural Center), verifichiamo se Rickettsia-infetti (R+) femmine fertilizzano più uova rispetto alle femmine (R.–) non infette.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è il primo a catturare il tasso di fertilizzazione o rapporto primario del sesso di b. tabaci. La sfida del presente protocollo è che richiede ai ricercatori di imparare a gestire le uova di mosche bianche rapidamente, garantendo che non più di 1 h è passato dal momento che le uova erano oviposited fino a quando non sono fissi. Durante gli esperimenti preliminari, uova che sono stati corretti alle 3h o più postoviposition erano troppo vecchie per osservare la fecondazione, come singamia av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione di NSF (DEB-1020460) a M.S.H. e una sovvenzione di USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Gli autori ringraziano Brennan Zehr per la macchiatura uova di mosche bianche con molta abilità e Zen. Gli autori ringraziano Mike Riehle per consentire l’uso del suo microscopio a fluorescenza per l’imaging. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Marco Gebiola per le immagini di uovo. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Jimmy Conway per aiutare nei momenti cruciali durante gli esperimenti.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
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