Summary

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

Published: May 15, 2019
doi:

Summary

IDBac is een open-source massaspectrometrie gebaseerde bioinformatica pijpleiding die gegevens van zowel intact eiwit en gespecialiseerde metaboliet spectra, verzameld op celmateriaal geschuurd uit bacteriële kolonies integreert. De pijpleiding stelt onderzoekers in staat om snel honderden tot duizenden bacteriële kolonies in putatieve taxonomische groepen te organiseren en ze verder te differentiëren op basis van gespecialiseerde metaboliet productie.

Abstract

Om de relatie te visualiseren tussen bacteriële fylogenie en gespecialiseerde metaboliet productie van bacteriële kolonies die groeien op nutriënt agar, ontwikkelden we IDBac-een low-cost en high-throughput matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) bioinformatica pijpleiding. IDBac software is ontworpen voor niet-experts, is vrij beschikbaar, en in staat om een paar te analyseren om duizenden bacteriële kolonies. Hier presenteren we procedures voor de bereiding van bacteriële kolonies voor MALDI-TOF MS-analyse, MS-instrument bediening en gegevensverwerking en visualisatie in IDBac. In het bijzonder, we instrueren gebruikers hoe te cluster bacteriën in dendrogrammen op basis van eiwit MS vingerafdrukken en interactief maken metaboliet Association Networks (MANs) van gespecialiseerde metaboliet gegevens.

Introduction

Een belangrijke barrière voor onderzoekers die bacteriële functie bestuderen, is de mogelijkheid om de taxonomische identiteit van een micro-organisme snel en gelijktijdig te beoordelen en zijn capaciteit om gespecialiseerde metabolieten te produceren. Dit heeft aanzienlijke vooruitgang in het begrijpen van de relatie tussen bacteriële fylogenie en gespecialiseerde metaboliet productie in de meeste bacteriën geïsoleerd uit de omgeving voorkomen. Hoewel MS-gebaseerde methoden die eiwit-vingerafdrukken gebruiken om bacteriën te groeperen en te identificeren, goed worden beschreven1,2,3,4, zijn deze studies over het algemeen uitgevoerd op kleine groepen isolaten, op soortspecifieke wijze. Belangrijk is dat informatie over gespecialiseerde metaboliet productie, een belangrijke driver van microbiële functie in het milieu, in deze studies is gebleven. Silva et al.5 heeft onlangs een uitgebreide geschiedenis gegeven waarin het ondergebruik van MALDI-TOF MS gedetailleerd wordt uitgelegd om gespecialiseerde metabolieten en het tekort aan software te analyseren om de huidige knelpunten in de bioinformatica te verlichten. Om deze tekortkomingen aan te pakken, creëerden we IDBac, een bioinformatica-pijpleiding die zowel lineaire als reflectieve modi van MALDI-TOF MS6integreert. Dit stelt gebruikers in staat om snel te visualiseren en differentiëren bacteriële isolaten op basis van zowel eiwit en gespecialiseerde metaboliet MS vingerafdrukken, respectievelijk.

IDBac is kosteneffectief, hoge doorvoer en ontworpen voor de leken gebruiker. Het is vrij beschikbaar (chasemc.github.io/IDBac), en vereist alleen toegang tot een MALDI-TOF massaspectrometer (reflectron-modus zal nodig zijn voor gespecialiseerde metaboliet analyse). Monstervoorbereiding berust op de eenvoudige “Extended direct Transfer” methode7,8 en gegevens worden verzameld met opeenvolgende lineaire en reflectron overnames op een enkele MALDI-target plek. Met IDBAC is het mogelijk om de vermoedelijke fylogenie en gespecialiseerde metaboliet productie van honderden kolonies in minder dan vier uur te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, gegevensverzameling en gegevensvisualisatie. Dit biedt een aanzienlijk tijd-en kostenvoordeel ten opzichte van traditionele methoden voor het identificeren van bacteriën (zoals gensequencing) en het analyseren van metabole output (vloeistofchromatografie-massaspectrometrie [LCMS] en soortgelijke chromatografische methoden).

Met behulp van gegevens verkregen in lineaire modus analyse, maakt IDBAC gebruik van hiërarchische clustering om de verwantschap van eiwit Spectra weer te geven. Omdat de spectra meestal geïoniseerde ribosomale eiwitten vertegenwoordigen, bieden ze een representatie van de fylogenetische diversiteit in een monster. Daarnaast bevat IDBac reflectron-modus gegevens om gespecialiseerde metaboliet-vingerafdrukken als metaboliet Association Networks (MANs) weer te geven. MANs zijn bipartiete netwerken die het mogelijk maken voor een eenvoudige visualisatie van de gedeelde en unieke metaboliet productie tussen bacteriële isolaten. Het IDBac-platform stelt onderzoekers in staat om zowel eiwitten als gespecialiseerde metaboliet gegevens in tandem te analyseren, maar ook afzonderlijk als slechts één gegevenstype wordt verworven. Belangrijk is dat IDBac onbewerkte gegevens verwerkt van Bruker-en Xiamen-instrumenten, evenals txt, tab, CSV, mzXML en mzML. Dit elimineert de noodzaak voorhand matige conversie en opmaak van gegevenssets, en vermindert aanzienlijk het risico van gebruikers fouten of verkeerd gebruik van MS-gegevens.

Protocol

1. bereiding van de MALDI-matrix Bereid 10 mg/mL MALDI-grade, en/of herkristalliseerd α-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (CHCA) in oplosmiddelen van MS-kwaliteit: 50% acetonitril (ACN), 47,5% water (H2O), 2,5% trifluorazijnzuur (TFA). Voorbeeld: 100 μL oplossing = 50 μL ACN + 47,5 μL H2O + 2,5 ΜL TFA + 1 mg chca Bereid ten minste 1 μL matrix oplossing per MALDI-plaat vlek en Vortex of sonicatie tot in de oplossing (ongeveer 5 minuten ultrasoonapparaat of geen zichtbare vaste stoffen).Let op: TFA is een sterk zuur dat moet worden behandeld in een chemische rook afzuigkap tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, omdat het de huid, ogen en luchtwegen kan beschadigen met contact of inademing.Opmerking: CHCA is hygroscopisch en lichtgevoelig en moet worden opgeslagen in Amber flesjes in een exsiccator. Er zijn veel MALDI matrix opties beschikbaar. CHCA is het meest gebruikelijk voor eiwit profilering van bacteriën, maar werkt ook voor gespecialiseerde metaboliet analyse. Matrix selectie is afhankelijk van individuele gebruiker/experiment behoeften. 2. bereiding van de doelplaten van MALDI Opmerking: Zie Sauer et al.7voor meer informatie. Spoel MALDI-plaat met methanol (HPLC-kwaliteit of hoger) en veeg droog met zachte papieren doekjes. Gebruik geen schuurborstels bij het reinigen van doelplaten, omdat dit het oppervlak van de doelplaat blijvend kan beschadigen. Wijs eiwit en gespecialiseerde metaboliet kalibrerende vlekken toe. Organiseer kalibratie spots gelijkmatig over de populatie van het monster, om rekening te kunnen maken met MALDI-plaat-onregelmatigheden en instrument drift na verloop van tijd. Wijs een passend aantal media/matrix-blanco plekken toe voor de studie; deze vlekken zullen alleen media en matrix bevatten, of alleen matrix. Gebruik een steriele tandenstoker en breng een klein gedeelte van een bacterie kolonie over naar de juiste plek op de MALDI-plaat. Verdeel de bacterie kolonie gelijkmatig over de plek. De plek moet zo plat mogelijk worden weergegeven.Opmerking: het zal gemakkelijker zijn om bacteriële kolonies die meer mucoïde/amorf zijn te afvlakken. Voor meer stijve/vaste kolonies, Vermijd het verlaten van zichtbare clusters van celmassa op de MALDI-vlek (Figuur 1). Figuur 1: MALDI-doelplaat die twee verschillende isolaten weergeeft alvorens mierenzuur en MALDI matrix toe te voegen (top 3 spots- Bacillus SP.; onderste 3 spots- Streptomyces SP.). Voor beide, kolom 3 staat voor overtollige steekproef; kolom 2 staat voor de juiste hoeveelheid monster; kolom 1 geeft onvoldoende voorbeeld voor MALDI-analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Bereid een matrix/media-regeling met behulp van een steriele tandenstoker om een minimale hoeveelheid agar/medium over te brengen op de juiste spot (en) op de MALDI-plaat. Overlay 1 μL van 70% massaspectrometrie graad mierenzuur op elke monster vlek, met inbegrip van de matrix controle vlekken. Laat zuur aan de lucht volledig drogen in een chemische rook afzuigkap (ongeveer 5 min).Let op: mierenzuur is een bijtende chemische stof en moet worden behandeld in chemische rook afzuigkappen. Het kan de luchtwegen beschadigen bij inademing. Voeg 1 μL van de bereide MALDI-matrix oplossing toe aan elke sample spot, evenals aan de matrix/Media Control spots. Laat de matrix oplossing volledig drogen (ongeveer 5 min).Opmerking: het is mogelijk om de plaat in een exsiccator te bewaren, in het donker, totdat deze kan worden geanalyseerd op een MALDI-TOF massaspectrometer. Toegestane opslag tijden kunnen variëren afhankelijk van de monster stabiliteit. Voeg 0,5 – 1,0 μL kalibrering toe aan de toegewezen ijkpunten, gevolgd door 1 μL MALDI-matrix oplossing. Pipetteer de resulterende oplossing op en neer om te mengen. Laat alle plekken in de lucht volledig drogen voorafgaand aan de introductie in de MALDI-TOF massaspectrometer.Opmerking: de eiwitten en gespecialiseerde metaboliet kalibranten moeten worden toegevoegd binnen 30 min van MALDI analyse, omdat beide vatbaar zijn voor degradatie. 3. gegevensverzameling Opmerking: de algemene parameters voor het verzamelen van gegevens worden weergegeven in tabel 1. Parameter Eiwit Gespecialiseerde metaboliet Massa start (da) 1920 60 Massa-einde (da) 21000 2700 Massa afbuiging (da) 1900 50 Shots 500 1000 Frequentie (Hz) 2000 2000 Laser grootte Grote Medium MaxStdDev (ppm) 300 30 Tabel 1. Volg de specifieke protocollen voor het gebruikte instrument en stel zowel eiwitten als gespecialiseerde metaboliet kalibraties in. Test enkele afzonderlijke doelpunten om de optimale Laser stroom en detector versterking te bepalen voor gebruik bij het verkrijgen van spectra (dit varieert per dag en per instrument).Opmerking: Figuur 2a en Figuur 3a vertonen optimale spectra, terwijl figuur 2D en figuur 3D voorbeelden zijn van spectra van slechte kwaliteit. Figuur 2: Voorbeeld van proteïne spectra die het effect van het wijzigen van laser vermogen en detector versterking weergeven. Spectra kwaliteit is het beste in paneel A, en verlaagt tot onvoldoende Spectra kwaliteit in panelen C en D. Terwijl het spectrum in paneel B kan resulteren in bruikbare pieken, geeft panel A optimale gegevens weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Voorbeeld gespecialiseerde metaboliet Spectra tonen het effect van het aanpassen van laser vermogen en detector Gain. De kwaliteit van spectra is het beste in paneel A en neemt af tot de kwaliteit van de spectra in deelvensters C en Donvoldoende is. Terwijl het spectrum in paneel B kan resulteren in bruikbare pieken, geeft panel A optimale gegevens weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Verkrijg spectra, het opslaan van eiwit spectra in één map en gespecialiseerde metaboliet spectra in een tweede, aparte map. 4. reiniging van de MALDI-doelplaat (aangepast van Sauer et al.7) Verwijder de MALDI-doelplaat uit de houder en spoel met aceton. Wassen met een niet-schurende vloeibare zeep om Trace eiwitten en lipiden te verwijderen, en zachte papieren doekjes/zacht-bristled tandenborstel. Spoel ongeveer 2 minuten met gedeïoniseerd water om de zeep volledig te verwijderen. Sonicate de doelplaat in water (HPLC-kwaliteit of hoger) gedurende 5 minuten. Spoel de doelplaat met water (HPLC-kwaliteit of hoger). Spoel de doelplaat met methanol (HPLC-kwaliteit of hoger). 5. de IDBac software installeren Download de IDBac software.Opmerking: permanente, versiebeheer back-ups zijn ook beschikbaar om te downloaden (Zie de tabel met materialen). Dubbelklik op het gedownloade “Install_IDBac. exe” om het installatieprogramma te starten en volg de instructies op het scherm. 6. beginnen met onbewerkte gegevens Opmerking: gedetailleerde uitleg en instructies van elke gegevensverwerkings stap zijn ingebed in IDBac, maar de belangrijkste analyses en interactieve ingangen worden hieronder beschreven. Dubbelklik op de snelkoppeling op het bureaublad IDBac om IDBac te starten. IDBac wordt standaard geopend op het tabblad Inleiding . Gebruik de knop controleren op updates om ervoor te zorgen dat de meest recente versie van IDBAC wordt gebruikt (internettoegang vereist). Als er een nieuwere versie beschikbaar is, zal IDBac de update automatisch downloaden en installeren, waarna IDBac zal verzoeken om opnieuw te worden opgestart. Klik op het tabblad beginnen met onbewerkte gegevens en kies uit het menu het type gegevens dat moet worden gebruikt met IDBAC; Volg de instructies in de app. Bij het instellen van de conversie en verwerking van gegevensbestanden, voer een beschrijvende naam voor het experiment wanneer hierom wordt gevraagd (Zie afbeelding 4). Experimenten worden later alfabetisch weergegeven, dus een nuttige strategie is om te beginnen met het experiment namen met een groep-kenmerk (bijvoorbeeld “Bacillus-trials_experiment-1”; “Bacillus-trials_experiment-2”). Figuur 4: IDBac gegevensconversie en voor verwerking stap. IDBac converteert RAW Spectra naar het open mzML formaat en slaat mzML, Peak lists en sample informatie op in een database voor elk experiment. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 7. werken met eerdere experimenten Na het converteren van bestanden en het verwerken ervan met IDBac, of op elk moment dat u een experiment opnieuw wilt analyseren, navigeert u naar de pagina werken met vorige experimenten en selecteert u een experiment om mee te werken (Figuur 5). Afbeelding 5: pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘. Gebruik de pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘ van IDBac om een experiment te selecteren dat u wilt analyseren of wijzigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Optionele Informatie over voorbeelden toevoegen met het menu Klik hier om het geselecteerde experiment te wijzigen. Voer informatie in het automatisch ingevulde werkblad in en druk op Save (Figuur 6). Met deze optie kan de gebruiker gegevens in kleur coderen tijdens analyses. Afbeelding 6: invoer voorbeeld informatie. In de pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘ kunnen gebruikersinformatie invoeren over samples zoals taxonomische identiteit, ophaallocatie, isolatie voorwaarden, etc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Optionele Breng alle of een subset van de voorbeelden over naar een nieuw of ander experiment door te klikken op voorbeelden van vorige experimenten overbrengen naar nieuwe/andere experimenten en de instructies te volgen (Figuur 7). Afbeelding 7: gegevens overdragen. De pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘ bevat de optie om gegevens over te brengen tussen bestaande experimenten en nieuwe experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Wanneer klaar om te beginnen met de analyse, zorg ervoor dat het experiment om te werken met is geselecteerd. Selecteer ofwel eiwit gegevensanalyse of kleine molecuul gegevensanalyse. 8. opzetten van eiwit data analyse en creëren van spiegel plots Als u eiwit gegevens analyseert, navigeert u eerst naar de pagina eiwit gegevensanalyse . Kies instellingen voor Peak-picking en evalueer de eiwit spectra van samples via de weergegeven spiegel plots (Figuur 8).Opmerking: in de spiegel plots geeft een rode piek de aanwezigheid van die piek alleen in het bovenste spectrum aan, terwijl blauwe pieken de punten vertegenwoordigen die zich in beide Spectra voordoen. Afbeelding 8: Kies hoe pieken worden bewaard voor analyse. Na het selecteren van een experiment om te analyseren, een bezoek aan de “eiwit Data Analysis” pagina en vervolgens het openen van de “Kies hoe pieken worden bewaard voor analyse” menu stelt gebruikers in staat om instellingen te kiezen, zoals signaal-ruis verhouding voor het behoud van pieken. De weergegeven spiegel plot (of dendrogram) wordt automatisch bijgewerkt om de gekozen instellingen weer te geven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Pas het percentage van de replicaten aan waarin een piek aanwezig moet zijn zodat deze voor analyses kan worden opgenomen (bijvoorbeeld als de drempelwaarde is ingesteld op 70% en een piek voorkomt in ten minste 7 van de 10 replicaten, wordt deze opgenomen). Gebruik de spiegel plots als visuele begeleiding, pas het signaal aan op ruisonderdrukking die de meest “echte” pieken en de minste ruis behoudt, waarbij wordt opgemerkt dat meer replicaten en een hogere waarde “percentage piek aanwezigheid” het mogelijk maakt een lager signaal te kiezen voor ruisonderdrukking. Geef de onderste en bovenste m/z Cutoffs, dicteren van het bereik van de massa-waarden binnen elk spectrum moet worden gebruikt in verdere analyses door IDBAC. 9. clustering monsters met behulp van eiwit gegevens Selecteer op de pagina eiwit gegevensanalyse het tabblad dendrogram . Dit maakt het mogelijk om monsters in een dendrogram te groeperen volgens door de gebruiker geselecteerde afstandsmetingen en clustering algoritmen. Klik op voor beelden selecteren in het menu en volg de instructies om monsters te selecteren die u in de analyses wilt opnemen. Alleen monsters die eiwit Spectra bevatten, worden weergegeven in het vak beschikbare monsters (Figuur 9). Afbeelding 9: Selecteer samples uit het gekozen experiment om op te nemen in het weergegeven dendrogram. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Gebruik de standaardwaarden of Selecteer onder clustering-instellingen kiezende gewenste afstand -en cluster algoritmen die moeten worden toegepast op het genereren van het dendrogram. Selecteer aanwezigheid/afwezigheid als invoer. Als alternatief, als u vertrouwen hebt in de piekhoogten van de monsters (bijvoorbeeld na het uitvoeren van een studie om de variabiliteit van de piek intensiteit te beoordelen), selecteert u intensiteiten als invoer.Opmerking: op het moment van publicatie biedt IDBac flexibiliteit in instellingen voor clustering, afhankelijk van gebruikers om de juiste combinaties te kiezen. Als deze opties niet bekend zijn, wordt voorgesteld om een: “cosinus”-afstand en “gemiddelde (UPGMA)”-clustering te koppelen; of B: “Euclidische” afstand, en “Ward. D2” clustering. Als u bootstrap-waarden wilt weergeven op het dendrogram, voert u een getal in tussen 2 en 1000 onder Boots riemen. Wanneer u resultaten rapporteert, kopieert u de tekst in de suggesties voor rapportage van de eiwitanalyse alinea. Dit biedt de gebruiker gedefinieerde instellingen die het specifieke dendrogram gegenereerd. 10. het eiwit dendrogram aanpassen Om te beginnen met het aanpassen van het dendrogram, opent u het menu dendrogram aanpassen (afbeelding 10). Figuur 10: Stel het dendrogram in. IDBac biedt een aantal opties voor het wijzigen van hoe het dendrogram eruitziet, deze kunnen worden gevonden in het menu “pas het dendrogram”. Dit omvat het kleuren van takken en labels door k-middelen, of door het “snijden” van het dendrogram op een door de gebruiker geleverde hoogte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Om de lijnen en/of labels van het dendrogram te kleuren, selecteert u de juiste knop: Klik om regels te wijzigen of Klik om labels te wijzigen en selecteer de gewenste opties. Als u informatie uit het werkblad naast het dendrogram wilt uitzetten (zie stap 7,2), selecteert u de knop informatie over voorbeelden opnemen. Hiermee wordt een deelvenster geopend waarin een categorie (kolom in het werkblad) zelf wordt ingevuld op basis van de ingevoerde waarden (afbeelding 11). Afbeelding 11: informatie over samples opnemen. In het “aanpassen van het dendrogram” menu is de optie “Integreer informatie over samples”. Als u dit selecteert, u informatie over voorbeelden naast het dendrogram laten plotten. De voorbeeld informatie wordt ingevoerd in de pagina ‘ werken met eerdere experimenten ‘. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 11. Steek monsters van een apart experiment in het dendrogram Als u voorbeelden uit een ander experiment wilt invoegen, selecteert u de menuknop voor beelden uit een ander experiment invoegen. Volg de aanwijzingen in het nieuw geopende paneel (afbeelding 12). Afbeelding 12: steek samples uit een ander experiment menu. Soms is het handig om samples van een ander experiment te vergelijken. Gebruik het menu “steek monsters uit een ander experiment” om monsters te kiezen die in het momenteel getoonde dendrogram moeten worden opgenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. 12. analyse van gespecialiseerde metaboliet gegevens en metaboliet Association Networks (MANs) Ga naar de metaboliet Association Network (Small-molecule) pagina. Deze pagina maakt het mogelijk voor gegevensvisualisatie door principe componenten Analysis (PCA) en MANs, die bipartiete netwerken gebruiken om de correlatie van kleine molecuul m/z -waarden met monsters weer te geven. Als een eiwit dendrogram is gemaakt (sectie 9), wordt het ook op deze pagina weergegeven. Klik-en-sleep op het dendrogram om geselecteerde monsters van belang te markeren die moeten worden geanalyseerd. Als er geen monsters zijn gemarkeerd of er geen eiwit dendrogram is gemaakt, zal een MAN met een willekeurige subset of alle monsters met respect verschijnen (Figuur 13). Afbeelding 13: kleine molecule Data Analysis “pagina. Als een dendrogram is gemaakt van eiwit spectra, zal het worden weergegeven in de “kleine molecule Data Analysis” pagina. Deze pagina wordt ook weergegeven metaboliet geassocieerde netwerken (MANs) en principe componenten analyse (PCA) voor kleine molecuul gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Als u een matrix/media leeg wilt maken in de MAN, opent u het menu Selecteer een voorbeeld om af te trekken en kiest u het juiste voorbeeld dat u als blanco wilt gebruiken. Open het menu Toon/VERBERG man instellingen om de gewenste waarden te selecteren voor percentage van piek aanwezigheid in replicaten, signaal naar ruis en boven-en ondermassa Cutoffs, zoals is gedaan voor eiwit spectra in rubriek 9. Gebruik de kleine molecule mirror plots om de selectie van deze instellingen te begeleiden. Selecteer ‘ huidige netwerkgegevens downloaden ‘ om de gegevens op te slaan van de MAN die op dat moment wordt weergegeven. Deze gegevens kunnen worden gebruikt in andere netwerk analyse software dan IDBac. Voor het rapporteren van resultaten kopieert u de tekst in de suggesties voor rapportage van man-analyse alinea. Dit biedt de gebruiker gedefinieerde instellingen gebruikt voor het genereren van de gemaakte MAN. 13. gegevens delen Elke IDBac “experiment” wordt opgeslagen als een enkele SQLite-database. Het bevat de geconverteerde mzML RAW spectra, gedetecteerde pieken en alle input informatie van de gebruiker over samples. Om een IDBac-experiment te delen, deelt u daarom gewoon het SQlite-bestand met dezelfde naam als het experiment (de bestandslocatie wordt weergegeven op de pagina werken met vorige experimenten ).

Representative Results

We analyseerden zes stammen van Micromonospora chokoriensis en twee stammen van Bacillus subtilis, die eerder werden gekenmerkt6, met behulp van gegevens beschikbaar op Doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Volgende aanwijzingen in het tabblad beginnen met onbewerkte gegevens hebben we de optie Klik hier om Bruker files te converteren en volgde de IDBAC-verstrekte instructies voor elke gegevensset (afbeelding 14). Nadat de geautomatiseerde conversie en voor verwerking/piek-pieken stappen zijn voltooid, we zijn overgegaan tot het maken van een nieuwe gecombineerde IDBac experiment door het overbrengen van monsters van de twee experimenten in een enkel experiment met zowel Bacillus en Micromonosopora monsters (Figuur 15). De resulterende analyse betrof het vergelijken van eiwit spectra met behulp van spiegel plots, zoals afgebeeld in Figuur 16, wat nuttig was voor het evalueren van de spectra kwaliteit en het aanpassen van de piek-picking instellingen. Afbeelding 17 geeft een screenshot van de resultaten van de eiwit clustering met de standaardinstellingen geselecteerd. Het dendrogram werd gekleurd door het aanpassen van de drempelwaarde op het perceel (verschijnt als een gestippelde lijn). Van nota is de duidelijke scheiding tussen geslachten, met zowel M. chokoriensis als B. subtilis isolaten clustering afzonderlijk. Afbeelding 18, Figuur 19en figuur 20 accentueren de mogelijkheid om Mans van door de gebruiker geselecteerde regio’s te genereren door te klikken en te slepen over het eiwit dendrogram. Hiermee konden we snel MANs maken om alleen de B. subtilis stammen (Figuur 18) te vergelijken, alleen de M. chokoriensis stammen (Figuur 19), en alle stammen tegelijkertijd (figuur 20). De primaire functie van deze netwerken is om onderzoekers te voorzien van een breed overzicht van de mate van gespecialiseerde metaboliet overlapping tussen bacteriën. Met deze gegevens in de hand, onderzoekers hebben nu de capaciteit om geïnformeerde beslissingen te nemen van slechts een kleine hoeveelheid materiaal geschuurd uit een bacteriële kolonie. Afbeelding 14: Spectra processing. Gedownloade Bruker autoFlex Spectra werden geconverteerd en verwerkt met behulp van IDBac. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 15: gecombineerd IDBac-experiment. Omdat de Micromonospora en Bacillus Spectra werden verzameld op verschillende MALDI doelplaten, werden de twee experimenten vervolgens samengevoegd tot een enkel experiment-“Bacillus_Micromonsopora”. Dit werd gedaan binnen de “werken met eerdere experimenten” tab, volg de aanwijzingen in het menu “Transfer samples van eerdere experimenten naar nieuwe/andere experimenten”. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 16: vergelijking. Micromonspora en Bacillus Spectra werden vergeleken met behulp van de spiegel plots binnen de “eiwit Data Analysis” pagina. Uiteindelijk zijn de standaard piek instellingen gekozen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Afbeelding 17: hiërarchische clustering. Hiërarchische Clustering, met behulp van standaardinstellingen, correct gegroepeerde Bacillus en Micromonospora isolaten. Het dendrogram werd gekleurd door het “snijden” van het dendrogram op een willekeurige hoogte (weergegeven als een onderbroken lijn) en 100 Boots riemen gebruikt om vertrouwen te tonen in vertakkingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 18: man gemaakt door het selecteren van de Bacillus SP. stammen uit het eiwit dendrogram toonde differentiële productie van gespecialiseerde metabolieten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 19: man gemaakt door het selecteren van de zes Micromonospora SP. stammen uit het eiwit dendrogram toonde differentiële productie van gespecialiseerde metabolieten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 20: man van Bacillus SP. en Micromonospora SP. stammen die een differentiële productie van gespecialiseerde metabolieten vertonen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De IDBac protocol Details bacteriële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet data-acquisitie en analyse van maximaal 384 bacteriële isolaten in 4 h door een enkele onderzoeker. Met IDBac is het niet nodig om DNA uit bacteriële isolaten te halen of gespecialiseerde metaboliet extracten te genereren uit vloeibare fermentatie-Bouillon en ze te analyseren met behulp van chromatografische methoden. In plaats daarvan worden eiwit-en gespecialiseerde metaboliet gegevens verzameld door eenvoudigweg materiaal van bacteriële kolonies rechtstreeks op een doelplaat van MALDI te verspreiden. Dit vermindert aanzienlijk de tijd en kosten die gepaard gaan met alternatieve technieken zoals 16S rRNA gensequencing en LCMS9.

Het is belangrijk om een matrix leeg en kalibratie vlekken toevoegen aan de MALDI plaat, en we raden het gebruik van een passend aantal replicaten om te zorgen voor reproduceerbaarheid en statistisch vertrouwen. Het aantal replicaten is afhankelijk van het experiment. Als een gebruiker bijvoorbeeld duizenden kolonies wil onderscheiden van een verzameling milieudiversiteits platen, kunnen er minder replicaten nodig zijn (ons lab verzamelt drie technische replicaten per kolonie). Als alternatief, als een gebruiker wenst te maken van een aangepaste database van stammen van specifieke bacteriële taxa om snel te bepalen subspecies classificaties van onbekende isolaten, dan zijn meer replicaties geschikt (ons lab verzamelt acht biologische replicaten per stam).

IDBac is een hulpmiddel voor het snel differentiëren van hoog-gerelateerde bacteriële isolaten op basis van putatieve taxonomische informatie en gespecialiseerde metaboliet productie. Het kan een aanvulling zijn of dienen als een voorloper van orthogonale methoden zoals diepgaande genetische analyses, studies waarbij de productie en functie van de metaboliet betrokken is, of karakterisering van gespecialiseerde metaboliet structuur door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie en/of LC-MS/MS.

Gespecialiseerde metaboliet productie (IDBac MANs) is zeer gevoelig voor bacteriële groeiomstandigheden, vooral met behulp van verschillende media, dat is een mogelijke beperking van de methode. Echter deze eigenschappen kunnen worden uitgebuit door de gebruiker, als IDBac kan gemakkelijk genereren van MANs tonen de verschillen in gespecialiseerde metaboliet productie onder een verscheidenheid van groei voorwaarden. Het is belangrijk op te merken dat terwijl gespecialiseerde metaboliet vingerafdrukken kunnen variëren door groei conditie, we hebben eerder aangetoond dat eiwit vingerafdrukken relatief stabiel over deze variabelen blijven (Zie Clark et al.6). Bij het omgaan met milieudiversiteits platen raden we aan vóór de analyse bacteriële isolaten te zuiveren om mogelijke bijdragen van naburige bacteriële cross-talk te verminderen.

Ten slotte is het ontbreken van een doorzoekbare publieke database van eiwit-MS-vingerafdrukken een belangrijke tekortkoming in het gebruik van deze methode om onbekende milieu bacteriën te classificeren. We creëerden IDBAC met dit in gedachten, en opgenomen geautomatiseerde conversie van gegevens in een community-geaccepteerde open-source Format (mzml)10,11,12 en ontwierp de software om het zoeken, delen en creëren van aangepaste databases. We zijn in het proces van het creëren van een grote openbare database (> 10000 volledig gekarakteriseerde stammen), die de indeling van sommige isolaten naar het soort niveau mogelijk maakt, inclusief links naar de toetredings nummers van GenBank indien beschikbaar.

IDBac is open source en de code is beschikbaar voor iedereen om hun gegevensanalyse en visualisatie behoeften aan te passen. We raden gebruikers aan om een uitgebreide reeks literatuur (Sauer et al.7, Silva et al.5) te raadplegen om hun experimentele doelen te helpen ondersteunen en ontwerpen. We hosten een forum voor discussie op: https://groups.Google.com/forum/#!forum/idbac en een manier om problemen met de software te rapporteren op: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; IJslandse onderzoeksfonds subsidie 152336-051; en University of Illinois bij Chicago Startup funds. Ook bedanken we de volgende bijdragers: Dr. Amanda Bulman voor hulp bij MALDI-TOF MS eiwit acquisitie parameters; Dr. Terry Moore en Dr. Atul Jain voor herkristalliszing alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix (CHCA).

Materials

Acetonitrile Fisher 60-002-65 LC-MS Ultra CHROMASOLV
Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument Bruker Daltonics
Bruker Daltonics Bacterial test standard Fisher NC0884024 Bruker Daltonics 8604530
Bruker Peptide Calibration standard Fisher NC9846988 Bruker Daltonics 8206195
Formic Acid Fisher Chemical A117-50 99.5+%, Optima LC/MS Grade
MALDI-TOF target Plate Bruker Daltonics
Methanol Fisher Chemical A456-500 Optima LC/MS Grade
Toothpicks any is ok
Trifluoroacetic acid Fisher AC293810010 99.5%, for biochemistry, ACROS Organics
Water VWR 7732-18-5 LC-MS
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma 28166-41-8 (C2020-25G) ≥98% (TLC), powder

References

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).
  3. Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  4. Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists. Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).
  5. Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis. Planta Medica. 82, 671-689 (2016).
  6. Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).
  7. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).
  8. Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., Böttger, E. C., Hombach, M. Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).
  9. Schumann, P., Maier, T. MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria. Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).
  10. Chambers, M. C., Maclean, B., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  11. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).
  12. Martens, L., Chambers, M., et al. mzML-a community standard for mass spectrometry data. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).

Play Video

Cite This Article
Clark, C. M., Costa, M. S., Conley, E., Li, E., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data. J. Vis. Exp. (147), e59219, doi:10.3791/59219 (2019).

View Video