Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern
Summary
Hier zeigen wir Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) von viralen Vektoren in den Kortex als effizienten und vereinfachten Ansatz zur Erzielung optogenetischer Expression über große kortikale Bereiche im Makakenhirn hinweg.
Abstract
In der Optogenetik von nicht-menschlichen Primaten (NHP) ist die Infektion großer kortikaler Bereiche mit viralen Vektoren oft eine schwierige und zeitaufwändige Aufgabe. Hier zeigen wir die Verwendung von Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) optogenetischer viraler Vektoren in primäre somatosensorische (S1) und motorische (M1) Kortiken von Makaken, um eine effiziente, weitverbreitete kortikale Expression von lichtempfindliche Ionenkanäle. Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren, die das rot verschobene Opsin C1V1 kodieren, das mit gelbem fluoreszierendem Protein (EYFP) verschmolzen ist, wurden unter MR-geführtem CED in den Kortex von Rhesusmakaken injiziert. Drei Monate nach der Infusion bestätigte die epifluoreszierende Bildgebung große Regionen optogenetischer Expression (>130 mm2) in M1 und S1 in zwei Makaken. Darüber hinaus konnten wir zuverlässige lichtevokierte elektrophysiologische Reaktionen aus den exzessierten Bereichen mit mikroelektrokortikographischen Arrays aufzeichnen. Spätere histologische Analysen und Immunflecken gegen den Reporter ergaben eine weit verbreitete und dichte optogenetische Expression in M1 und S1, die der Verteilung entspricht, die durch epifluoreszierende Bildgebung angezeigt wird. Diese Technik ermöglicht es uns, innerhalb eines kürzeren Zeitraums mit minimalen Schäden im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken Expression über große Bereiche des Kortex zu erhalten und kann ein optimaler Ansatz für die optogenetische Virusabgabe bei großen Tieren wie NHPs sein. Dieser Ansatz zeigt ein großes Potenzial für die Manipulation neuronaler Schaltkreise auf Netzwerkebene mit Zelltyp-Spezifität in Tiermodellen, die evolutionär nah am Menschen sind.
Introduction
Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Manipulation der neuronalen Aktivität und die Untersuchung von Netzwerkverbindungen im Gehirn ermöglicht. Die Implementierung dieser Technik bei nicht-menschlichen Primaten (NHPs) hat das Potenzial, unser Verständnis von groß angelegter neuronaler Berechnung, Kognition und Verhalten im Primatengehirn zu verbessern. Obwohl die Optogenetik in den letzten Jahren erfolgreich in NHPs implementiert wurde1,2,3,4,5,6,eine Herausforderung, die Forscher gesicht endiebe hohe Ausdrucksniveaus über große Hirnbereiche bei diesen Tieren. Hier bieten wir einen effizienten und vereinfachten Ansatz, um ein hohes Maß an optogenetischer Expression über große Bereiche des Kortex in Makaken zu erreichen. Diese Technik hat großes Potenzial, aktuelle optogenetische Studien an diesen Tieren inKombination mit modernsten Aufnahmen 8,9 und optischestimulation10 Technologien zu verbessern.
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine etablierte Methode der Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen und anderen großen Molekülen, einschließlich viraler Vektoren, an das zentrale Nervensystem11,12,13. Während herkömmliche Verabreichungsmethoden mehrere Infusionen mit geringem Volumen beinhalten, die über kleine Regionen des Gehirns verteilt sind, kann CED eine breitere und gleichmäßigere Agentenverteilung mit weniger Infusionen erreichen. Druckgetriebene Massenflüssigkeitsströme (Konvektion) während der Infusion ermöglichen eine breitere und gleichmäßig verteilte Transduktion des Zielgewebes bei der Bereitstellung viraler Vektoren mit CED. In neueren Studien haben wir die Transduktion und anschließende optogenetische Expression großer Bereiche der Primärmotor (M1) und somatosensorischen (S1) Kortika9 und Thalamus14 mit Magnetresonanz (MR)-geführtem CED nachgewiesen.
Hier skizzieren wir die Verwendung von CED, um eine optogenetische Expression über große kortikale Bereiche mit nur wenigen kortikalen Injektionen zu erreichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier skizzieren wir eine praktikable und effiziente Technik zur Erzielung einer großflächigen optogenetischen Expression in NHP primärssomatosensorischer und motorischer Kortex durch MR-geführte CED. Die Verwendung von MR-geführtem CED bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der viralen Infusion im NHP-Gehirn. Ein solcher Vorteil ist die Fähigkeit, Expression über große Gebiete mit weniger erforderlichen Infusionen zu erreichen. Zum Beispiel, mit herkömmlichen Methoden, Mehrfachinjektionen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von American Heart Association Postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940 und vom UCSF Neuroscience Imaging Center. Diese Arbeit wurde auch vom Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K12HD073945, dem Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425) und das Center for Neurotechnology (CNT, ein Forschungszentrum der National Science Foundation Engineering Research Center unter Grant EEC-1028725). Wir danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani und Blakely Andrews für ihre Hilfe bei den Experimenten und Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz und Toni Haun für die technische Hilfe.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
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