स्तन ग्रंथियों से किरणित ऑर्गेनॉयड की वृद्धि और लक्षण वर्णन
Summary
माउस से विकसित आर्गेनॉइड स्तन ग्रंथियों किरणित और उपकला लक्षण और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत का आकलन विशेषता थे । विकिरणित ऑर्गेनॉइड सेल-सेल इंटरैक्शन का बेहतर मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो किरणित सामान्य ऊतक में ट्यूमर कोशिका भर्ती के लिए नेतृत्व कर सकता है ।
Abstract
पाचन ऊतक से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉयड तीन आयामी (3 डी) constructs कि बेहतर सेल monolayers की तुलना में vivo शर्तों में संक्षेप हैं । हालांकि वे पूरी तरह से vivo में जटिलता मॉडल नहीं कर सकते, वे मूल अंग की कुछ कार्यशीलता को बनाए रखने । कैंसर के मॉडल में, ऑर्गेनॉइड सामांयतः ट्यूमर कोशिका आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सामान्य ऊतकों में विकिरण प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए सामान्य और विकिरणित माउस स्तन ग्रंथि ऊतक से ऑर्गेनॉयड को विकसित और चित्रित करना है । इन ऑर्गेनॉइड विट्रो कैंसर अध्ययन में भविष्य के लिए लागू किया जा सकता है विकिरण ऑर्गेनॉयड के साथ ट्यूमर कोशिका बातचीत का मूल्यांकन । स्तन ग्रंथियों का पुनर्विच्छेदन किया गया, 20 जीवाई के लिए किरणित और एक collagenase आठवीं समाधान में पचा । उपकला ऑर्गेनॉइड केंद्रापसारक विभेदन के माध्यम से अलग थे, और 3 डी ऑर्गेनॉइड ९६ में विकसित-अच्छी तरह से कम आसंजन माइक्रोप्लेट्स थे । ऑर्गेनॉइड विशेषता उपकला मार्कर cytokeratin 14 व्यक्त की है । सह-संस् कृति प्रयोगों में ऑर्गेनॉयड के साथ मैक्रोफेज अन्योन्य क्रिया देखी गई इस मॉडल ट्यूमर-stromal बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ, और एक किरणित microenvironment के भीतर महाविभोजी ध्रुवीकरण.
Introduction
लगभग ६०% ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (टीएनबीसी) के रोगियों के उपचार के एक फार्म के रूप में स्तन संरक्षण चिकित्सा (BCT) का चयन1। इस इलाज के साधन में, स्तन ऊतक के भाग युक्त ट्यूमर को हटा दिया जाता है, और आसपास के सामान्य ऊतक किसी भी अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए विकिरण ionizing के संपर्क में है । उपचार स्तन कैंसर आबादी की बहुत में पुनरावृत्ति कम कर देता है; तथापि, लगभग १३.५% टीएनबीसी अनुभव के साथ रोगियों का इलाज locoregional पुनरावृत्ति2। इसलिए, अध्ययन कैसे विकिरण ट्यूमर कोशिकाओं (ctcs) परिसंचारी भर्ती कर सकते है स्थानीय पुनरावृत्ति3,4में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व करेंगे ।
पिछले काम से पता चला है कि सामांय ऊतक के विकिरण विभिंन प्रकार के सेल की भर्ती बढ़ जाती है5। TNBC के पूर्व नैदानिक मॉडलों में, सामान्य ऊतक के विकिरण में मैक्रोफेज और बाद में सामान्य ऊतकों के लिए ट्यूमर सेल भर्ती में वृद्धि हुई5. प्रतिरक्षा की स्थिति को प्रभावित ट्यूमर कोशिका के लिए भर्ती किरणित साइटों, ट्यूमर कोशिका प्रवास के साथ प्रतिरक्षा विषयों में मनाया । स्तन ग्रंथियों से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉयड का उपयोग कर इन बातचीत को पुनः पूंजीकरण माइक्रोस्कोपी और लाइव सेल इमेजिंग के साथ वास्तविक समय में सेल माइग्रेशन और सेल-stromal बातचीत के अवलोकन की अनुमति देगा बदलने में विकिरण क्षति की भूमिका का निर्धारण करने के लिए ट्यूमर सेल व्यवहार ।
माउस स्तन ऑर्गेनॉइड स्तन ग्रंथि के विकास में महत्वपूर्ण कदम स्पष्ट मदद की है । एक स्तन अंगाभ है एक बहु कोशिकीय, तीन आयामी अलग स्तन उपकला है कि ५० μm6,7,8,9,10से बड़ा है का निर्माण । प्राथमिक उपकला ऑर्गेनॉयड का उपयोग करना, सिमियां एट अल. स्तन ग्रंथि में शाखाओं में बंटी के लिए आवश्यक कारकों का मूल्यांकन7. शमिर एट अल. पता चला कि प्रसार मध्योतक संक्रमण के लिए एक उपकला के बिना हो सकता है, मेटास्टेटिक झरना8में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । स्तन ग्रंथि ऊतक से पैदा करने और अभिलक्षणन ऑर्गेनॉइड के लिए तरीके6,11,12,13अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं । तथापि, हमारी जानकारी के लिए, स्तन ग्रंथियों से विकिरणित ऑर्गेनॉयड उगाने के तरीकों की सूचना नहीं दी गई है । विकिरणित ऑर्गेनॉइड के बढ़ने और विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल विकिरण प्रेरित प्रतिरक्षा और ट्यूमर कोशिका भर्ती को पुनः पूंजीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम होगा ।
इस कागज में, हम बढ़ रही है और एक हाइड्रोफिलिक बहुलक है कि spheroids के गठन का समर्थन करता है के साथ लेपित कम आसंजन माइक्रोप्लेट्स में विकिरणित स्तन उपकला ऑर्गेनॉइड की विशेषता के लिए एक विधि की रिपोर्ट । इन ऑर्गेनॉयड प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ कैनेटीक्स की जांच करने के लिए मैक्रोफेज के साथ सह-संस्कारी थे । यह काम वसा कोशिकाओं के साथ सह-culturing ऑर्गेनॉयड शामिल करने के लिए स्तन विशेषताओं, स्तन कैंसर कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिका भर्ती कल्पना करने के लिए, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं को ट्यूमर-प्रतिरक्षा सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । पहले स्थापित प्रोटोकॉल किरणित ऑर्गेनॉयड का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इससे पहले के मॉडलों में स् ममैरी ऑर्गेनॉयड और प्रतिरक्षा कोशिकाओं ने मेटास्टेसिस और प्रसार के तंत्र पर प्रकाश डाला है । डेन्कार्डो एट अल. पाया गया कि सीडी 4 + T कोशिका विनियमन ट्यूमर संबद्ध मैक्रोफेज के एक मेटास्टेटिक फेनोटाइप के स्तन को बढ़ाया14. जैविक विकास के तंत्रों को स्पष्ट करने के लिए सह-संस्कृति मॉडलों का भी प्रयोग किया गया है । Plaks एट अल. के रूप में सीडी 4 + टी कोशिकाओं की भूमिका को स्पष्ट किया स्तन ऑर्गेनोजेनेसिस के नियामकों15। हालांकि, हमारे समूह को visualizing कैसे सामांय ऊतक किरणन प्रतिरक्षा सेल व्यवहार को प्रभावित करता है की एक प्रक्रिया स्थापित करने के लिए पहली बार है । क्योंकि सामांय ऊतक विकिरण ट्यूमर सेल भर्ती5को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल और आगे का विश्लेषण कैसे ट्यूमर कोशिका व्यवहार सामांय ऊतक और कोशिकाओं के विकिरण से बदल रहा है विकसित किया जा सकता है, की एक बड़ी समझ के लिए अग्रणी कैंसर पुनरावृत्ति ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हमने पुनरुद्देशणीय विकास और विकिरणित स्तन ऑर्गेनॉइड के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि विकसित की है (चित्र 1) । 20 Gy के एक विकिरण खुराक ट्यूमर सेल भर्ती5के vivo मॉडल में पिछले …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम GFP और Dटमॅटो लेबल कच्चे २६४.७ macrophages प्रदान करने के लिए Dr. लौरा एल Bronsart धंयवाद । इस शोध को एनआईएच ग्रांट #R00CA201304 ने आर्थिक रूप से सहारा दिया ।
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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