Method Article

نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية

DOI:

10.3791/59293

⸱

May 3rd, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم المشعة التي وضعت من الغدد الثديية الماوس وتتميز لتقييم الصفات الظهاريه والتفاعلات مع الخلايا المناعية. يمكن استخدام العضوية المشعة لتحسين تقييم تفاعلات خلايا الخلايا التي قد تؤدي إلى تجنيد الخلايا السرطانية في الانسجه الطبيعية المشعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العضوية المشتقة من الانسجه المهضومة هي بني متعددة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) التي تلخص أفضل في ظروف الجسم الخلوي من أحاديه الخلية. علي الرغم من انها لا يمكن ان نموذج تماما في تعقيد المجرية ، فانها تحتفظ ببعض وظائف الجهاز الأصلي. في نماذج السرطان ، وتستخدم عاده organoids لدراسة الورم الخلية الغزو. يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير وتوصيف الخلايا العضوية من انسجه الغدد الثديية العادية والمشعة للماوس لتقييم الاستجابة الاشعاعيه في الانسجه الطبيعية. هذه العضوية يمكن تطبيقها علي دراسات السرطان في المستقبل في المختبر لتقييم تفاعلات الخلايا السرطانية مع العضوي المشع. تم تقسيم الغدد الثديية ، المشع إلى 20 غراي وهضمها في محلول الثامن كولاجيناز. تم فصل العضوية الظهاريه عن طريق التمايز الطرد المركزي ، ووضعت العضوية الثلاثية الابعاد في الصفائح الدقيقة المنخفضة التصاق 96-حسنا. وأعرب organoids علامة ظهاري مميزه سيتوكيراتين 14. لوحظ تفاعل الضامة مع الهيكل العضوي في التجارب المشتركة في الثقافة. قد يكون هذا النموذج مفيدا لدراسة التفاعلات بين الأورام ، وتسلل الخلايا المناعية ، والاستقطاب الضام داخل بيئة مجهريه مشعة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حوالي 60 ٪ من المرضي سرطان الثدي الثلاثي السلبية (TNBC) اختيار العلاج الحفاظ علي الثدي (BCT) كشكل من اشكال العلاج1. في هذه الطريقة العلاج ، يتم أزاله الورم الذي يحتوي علي جزء من انسجه الثدي ، ويتعرض الانسجه الطبيعية المحيطة للإشعاع المؤين لقتل اي خلايا الورم المتبقية. العلاج يقلل من تكرار في الكثير من السكان سرطان الثدي. ومع ذلك ، ما يقرب من 13.5 ٪ من المرضي المعالجين مع TNBC تجربه التكرارات الاقليميه2. ولذلك ، فان دراسة كيفيه توظيف الإشعاع الخلايا السرطانية المتداولة (ctcs) سوف يؤدي إلى رؤى هامه في تكرار المحلية3،4.

وقد أظهرت الاعمال ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها لجنه الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعه فانديربيلت.

1-اعداد الفئران وحيازة الخلايا (المقتبسة من نغوين-نغوك وآخرون11)

  1. التضحية الفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع من العمر) باستخدام CO2 اختناق تليها خلع عنق الرحم. تنظيف الجلد باستخدام الايثانول 70 ٪.
  2. Resect الغدد الثديية البطن والثدي الاربيه من الفئران باستخدام مقص قبل تعقيمها وملقط. أزاله الغدد الليمفاوية قبل استئصالها. شطف في العقيمة 1x الفوسفات مخزنه المالحة (الشكل 1X).
  3. وضعه في أنابيب 15 مل مع 10 مل من دولب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول بنجاح المشعة الظهاريه الثديية الثدي من الغدد الثديية الماوس ، معالجتها ، ومثقف علي لوحات التصاق منخفضه (الشكل 1). تم اختبار الغلة organoid من قبل البذر في بيئات النمو المختلفة (الشكل 2A-G). خلايا البذر مباشره علي ثقافة الانسجه تعامل 10 سم لوحات الخلية أسفرت عن فرط نمو الخلايا الليفية. تم التعرف علي الخلايا الليفية تحت المجهر علي النقيض من المرحلة في أو بالقرب من نفس المستوي من التركيز كما organoids ، وانها سرعان ما نشات من organoids مطلي في غضون أيام قليله. ولوحظ أ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير طريقه لنمو وتوصيف الغدد الثديية المشعة التي يمكن استنساخها (الشكل 1). تم تطبيق جرعه التشعيع من 20 غراي لتعكس السابقة في نماذج الجسم الخارجي من الخلايا السرطانية التوظيف5. تشعيع الغدد الثديية السابقة الجسم العضوي قبل تشكيل organoid يسمح للعزل من اثار الضرر الإشعاعي دون تسلل المقابلة من الخلايا المناعية. تطوير نموذج الانسجه الطبيعية المشعة في المختبر يتيح العرض في الوقت الحقيقي من التفاعلات الخلوية التي قد تسهم في الإشعاع المستحثة CTC الت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة لورا ل. Bronsart لتوفير GFP و dTomato-المسمي RAW 264.7 الضامة. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل منحه المعاهد القومية للصحة #R00CA201304.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10٪ فورمالين محايدVWR16004-128
مضاد للسيتوكيراتين 14abcamab181595القطعة: GR3200524-3
ألبومين مصل البقرSigmaA1933-25G
الكولاجين من النوع الأولكورنينج354236
كولاجيناز من المطثية هيستوليتيكوم ، النوع الثامنسيجماC2139
كولاجيناز IGibco17018029
DMEM / F12Thermofisher11320-033
DNAseRoche10104159001
DPBSFisher14190250
E-CadherinCell Signaling24E10Lot: 13
FBSSigmaF0926
GentamicinGibco15750
الماعز المضادة للأرانب الثانويةabcamab150077أخضر
القطعة: GR3203000-1
الماعز المضادة للأرانب أبكام الثانويةab150080أحمر
القطعة: GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249Lot: TG2611041
الأنسولين (10 مجم / مل)SigmaI9278
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم ، 100xGibco51500-056
غشاء القاعدي Matrigel (غشاء القاعدي المستخرج من ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm)مختبرات Corning356237
Normal Serum SerumVector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 ألواح بئرThermo174927
PBSVWR10128-856
Pen / StrepFisher15140122
Phalloidinabcamab176757Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1NovusNBP1-85047Lot: C115428
Triton X-100 (4- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكول)SigmaX100-100ML
TrypsinGibco27250-018
Tween-20 (البولي إيثيلين جلايكول سوربيتان مونولورات)سيجماP1379-100ML
مخزن

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mammary OrganoidsIrradiated TissueCentrifugal DifferentiationLow Adhesion PlatesConfocal MicroscopyCytokeratin 14Macrophage InteractionCollagenase DigestionEpithelial MarkerTumor Stromal

Related Articles