Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

تم المشعة التي وضعت من الغدد الثديية الماوس وتتميز لتقييم الصفات الظهاريه والتفاعلات مع الخلايا المناعية. يمكن استخدام العضوية المشعة لتحسين تقييم تفاعلات خلايا الخلايا التي قد تؤدي إلى تجنيد الخلايا السرطانية في الانسجه الطبيعية المشعة.

Abstract

العضوية المشتقة من الانسجه المهضومة هي بني متعددة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) التي تلخص أفضل في ظروف الجسم الخلوي من أحاديه الخلية. علي الرغم من انها لا يمكن ان نموذج تماما في تعقيد المجرية ، فانها تحتفظ ببعض وظائف الجهاز الأصلي. في نماذج السرطان ، وتستخدم عاده organoids لدراسة الورم الخلية الغزو. يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير وتوصيف الخلايا العضوية من انسجه الغدد الثديية العادية والمشعة للماوس لتقييم الاستجابة الاشعاعيه في الانسجه الطبيعية. هذه العضوية يمكن تطبيقها علي دراسات السرطان في المستقبل في المختبر لتقييم تفاعلات الخلايا السرطانية مع العضوي المشع. تم تقسيم الغدد الثديية ، المشع إلى 20 غراي وهضمها في محلول الثامن كولاجيناز. تم فصل العضوية الظهاريه عن طريق التمايز الطرد المركزي ، ووضعت العضوية الثلاثية الابعاد في الصفائح الدقيقة المنخفضة التصاق 96-حسنا. وأعرب organoids علامة ظهاري مميزه سيتوكيراتين 14. لوحظ تفاعل الضامة مع الهيكل العضوي في التجارب المشتركة في الثقافة. قد يكون هذا النموذج مفيدا لدراسة التفاعلات بين الأورام ، وتسلل الخلايا المناعية ، والاستقطاب الضام داخل بيئة مجهريه مشعة.

Introduction

حوالي 60 ٪ من المرضي سرطان الثدي الثلاثي السلبية (TNBC) اختيار العلاج الحفاظ علي الثدي (BCT) كشكل من اشكال العلاج1. في هذه الطريقة العلاج ، يتم أزاله الورم الذي يحتوي علي جزء من انسجه الثدي ، ويتعرض الانسجه الطبيعية المحيطة للإشعاع المؤين لقتل اي خلايا الورم المتبقية. العلاج يقلل من تكرار في الكثير من السكان سرطان الثدي. ومع ذلك ، ما يقرب من 13.5 ٪ من المرضي المعالجين مع TNBC تجربه التكرارات الاقليميه2. ولذلك ، فان دراسة كيفيه توظيف الإشعاع الخلايا السرطانية المتداولة (ctcs) سوف يؤدي إلى رؤى هامه في تكرار المحلية3،4.

وقد أظهرت الاعمال السابقة ان الإشعاع من الانسجه الطبيعية يزيد من توظيف أنواع مختلفه من الخلايا5. في نماذج ما قبل السريرية من TNBC ، والتشعيع من الانسجه الطبيعية زيادة الضامة وبعد ذلك الورم الخلايا التوظيف إلى الانسجه الطبيعية5. وقد أثرت حاله المناعة علي تجنيد الخلايا السرطانية في المواقع المشعة ، مع ملاحظه هجره الخلايا السرطانية في المواد المناعية. تلخيص هذه التفاعلات باستخدام organoids المستمدة من الغدد الثديية سوف تسمح بمراقبه هجره الخلايا والتفاعلات الخلوية في الوقت الحقيقي مع المجهر والتصوير الخلوي الحي لتحديد دور الضرر الإشعاعي في تغيير سلوك الخلايا السرطانية.

ساعدت الغدد الثديية الماوس توضيح الخطوات الرئيسية في تطوير الغدة الثديية. و organoid الثديية هي متعددة الخلايا ، وبناء ثلاثي الابعاد من ظهاره الثديية المعزولة التي هي أكبر من 50 μm6، 7،8،9،10. باستخدام العضوية الظهاريه الاوليه ، Simian وآخرون تقييم العوامل اللازمة لتفريع في الغدة الثديية7. اكتشف شامير وآخرون ان النشر يمكن ان يحدث دون ظهاره للانتقال المستوي ، وتوفير نظره ثاقبه علي تتالي المنتشر8. طرق لتوليد وتوصيف العضوية من انسجه الغدد الثديية راسخة6,11,12,13. ومع ذلك ، علي حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن أساليب لزراعه العضوية المشعة من الغدد الثديية. ومن شان وضع بروتوكول لزراعه وتوصيف الخلايا العضوية المشعة ان يكون خطوه حاسمه في تلخيص المناعة المستحثة بالإشعاع والتجنيد في الخلية السرطانية.

في هذه الورقة ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لزراعه وتوصيف المشعة الثديية الظهاريه العضوية في الصفائح الدقيقة التصاق منخفضه المغلفة مع البوليمر ماء التي تدعم تشكيل خزان. وكانت هذه العضوية المستزرعة مع الضامة لفحص حركيه تسلل الخلايا المناعية. ويمكن توسيع هذا العمل لتشمل المشاركة في زراعه العضوية مع الخلايا الدهنية لتلخيص الخصائص الثديية, خلايا سرطان الثدي لتصور تجنيد الخلايا السرطانية, وخلايا CD8 + T لدراسة التفاعلات الخلايا المناعية الورم. ويمكن استخدام البروتوكولات المنشاة سابقا لتقييم العضوية المشعة. وقد سلطت النماذج السابقة المشاركة في التشكيل العضوي الثديي والخلايا المناعية الضوء علي أليات الانبثاث والنشر. وقد وجدت DeNardo وآخرون ان التنظيم الخلية الخلايا التائية + T من الضامة المرتبطة الورم تعزيز النمط الظاهري المنتشر من الأورام اللحمية الثديية14. كما استخدمت نماذج الثقافة المشتركة لتوضيح أليات التنمية البيولوجية. Plaks et al. أوضح دور الخلايا التائية + T كما أسفل المنظمين من العضوي الثديية15. ومع ذلك ، فان مجموعتنا هي أول من يؤسس اجراء لتصور كيف يؤثر تشعيع الانسجه الطبيعية علي سلوك الخلايا المناعية. لأنه قد ثبت تشعيع الانسجه العادية لتعزيز تجنيد الخلايا السرطانية5، يمكن تطوير هذا البروتوكول لتحليل كيفيه تغيير سلوك الخلايا السرطانية عن طريق تشعيع الانسجه الطبيعية والخلايا ، مما يؤدي إلى فهم أكبر تكرار السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها لجنه الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعه فانديربيلت.

1-اعداد الفئران وحيازة الخلايا (المقتبسة من نغوين-نغوك وآخرون11)

  1. التضحية الفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع من العمر) باستخدام CO2 اختناق تليها خلع عنق الرحم. تنظيف الجلد باستخدام الايثانول 70 ٪.
  2. Resect الغدد الثديية البطن والثدي الاربيه من الفئران باستخدام مقص قبل تعقيمها وملقط. أزاله الغدد الليمفاوية قبل استئصالها. شطف في العقيمة 1x الفوسفات مخزنه المالحة (الشكل 1X).
  3. وضعه في أنابيب 15 مل مع 10 مل من دولبيكو النسر تعديل وسائل الاعلام/المغذيات المخلوط F12 (DMEM/F12) للنقل. يمكن ان تبقي عينات بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية أو معالجتها علي الفور. ابقي علي الثلج
  4. العينات المشعة في 20 غراي باستخدام مصدر السيزيوم (الشكل 1B).
  5. 45 دقيقه بعد التشعيع ، مكان الغدد الثديية في لوحه الخلايا المعقمة 35 مم واللحم المفروم مع المشرط (الشكل 1c ، D). اللحم المفروم مع ما يقرب من 40 السكتات الدماغية حتى يرتاح الانسجه ويتم الحصول علي القطع التي ليست أكبر من حوالي 1 مم2 في المنطقة.
  6. نقل إلى محلول كولاجيناز في أنبوب الطرد المركزي 50 mL. حل كولاجيناز يتكون من 2 ملغ/مل كولاجيناز (انظر جدول المواد) ، 2 ملغ/مل التربسين ، 5 ٪ v/v الجنين البقري المصل (ار) ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، و 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين في الاعلام Dmem/F12. استخدام محلول كولاجيناز 10 مل لكل ماوس.
  7. مكان في حمام مياه في 37 درجه مئوية ، vortexing كل 10 دقيقه ل 30-60 دقيقه. اكتمال الهضم عندما حل كولاجيناز هو غائم (الشكل 1E ، F).
  8. أدر المحلول المهضوم عند 450 × g لمده 10 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT). سيتم ملاحظه ثلاث طبقات. ويتكون ماده طافي من الدهون ، والطبقة الوسطي هو محلول مائي ، والجزء السفلي هو بيليه. وسوف تظهر بيليه الأحمر كما هو خليط من الخلايا الظهاريه ، الخلايا اللحمية الفردية ، وخلايا الدم الحمراء (الشكل 1G).
  9. ما قبل الشوفان جميع الماصات ، ونصائح ماصه ، وأنابيب الطرد المركزي مع الزلال مصل الدم (بوسنيا) الحل قبل الاتصال. ويتالف حل جيش صرب الجمهورية من 2.5 في المائة من الصرب في الفوسفات المخزن في المحلول الملحي في دولبيكو (DPBS). لطلاء ما قبل ، ببساطه أضافه ثم أزاله الحل جيش صرب البوسنيين إلى الداخل من طرف ماصه وأنابيب. يمكن أعاده استخدامها حل جيش صرب البوسنيين ، علي الرغم من انه ينبغي ان تكون معقمه تصفيتها قبل كل تجربه.
  10. لمزيد من الانتعاش ، ونقل ماده طافي إلى الطازجة جيش صرب البوسنيين المغلفة أنبوب 15 مل. ماصه صعودا وهبوطا بقوة لتفريق طبقه الدهون. أجهزه الطرد المركزي في 450 x g لمده 10 دقيقه في RT. يستنشق supernatant ، تاركا كميه صغيره من وسائل الاعلام في أنبوب لتجنب شفط بيليه الخلية.
  11. يستنشق الطبقة المائية من الأنبوب مع بيليه الأصلي.
  12. أضافه 10 مل من DMEM/F12 إلى أنبوب مع بيليه الأصلي ونقل إلى الأنبوب الثاني. ماصه بقوة للجمع بين وأعاده تعليق الكريات اثنين.
  13. جهاز الطرد المركزي في 450 x g لمده 10 دقيقه في RT. يستنشق ماده طافي وأضافه 4 مل من dmem/F12 إلى الأنبوب.
  14. أضافه 40 μL من deoxyribonase (DNase) إلى تعليق ويهز بلطف باليد ل 2-5 دقيقه في RT. DNase الحل يتكون من 4 ش/مل DNase في DMEM/F12.
  15. أضافه 6 مل من DMEM/F12 وماصه تماما. الطرد المركزي أنبوب في 450 x g لمده 10 دقيقه في RT.
  16. يستنشق ماده طافي إلى علامة 0.5 mL. أعاده التعليق في 10 مل من DMEM/F12 وماصه تماما.
  17. نبض إلى 450 x g وتوقف 4 s بعد الوصول إلى تلك السرعة.
  18. كرر الخطوات 1.16-1.17 ثلاث مرات أخرى لتنقيه الهيكل العضوي عبر التفريق الطرد المركزي. يجب ان يكون بيليه الآن لون خارج البيضاء تتكون من العضوية الظهاريه فقط (الشكل 1H).
    ملاحظه: يمكن أيضا ان تتم تصفيه Organoids باستخدام مرشحات شبكه معقمه 40 μm. بعد الخطوة 1.16 ، الوسائط الماصة التي تحتوي علي organoids من خلال فلتر في أنبوب الطرد المركزي ، ومن ثم شطف مع 5 إلى 10 مل من الوسائط DMEM/F12. اقلب الفلتر علي أنبوب الطرد المركزي 50 mL الجديد. تمرير 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 من خلال ، والذهاب في الطريق المعاكس لشطف اي retentate. يجب ان تتكون المصفاة من organoids ، وينبغي ان تتكون الترشيح أساسا من الخلايا اللحمية ، والتي يمكن التخلص منها أو الاحتفاظ بها إذا رغبت في ذلك.

2. تحديد الكثافة والطلاء organoids

  1. أعاده التعليق بيليه في 10 مل من DMEM/F12. ماصه جيدا لخلق حل متجانس.
  2. نقل 50 μL إلى صحن بيتري 30 ملم ، وعرض تحت المجهر النقيض المرحلة في 20x. احسب عدد العضو العضوي مع عداد العد.
    ملاحظه: هنا تم استخدام نصائح ماصه باستمرار مع الحد الأدنى من قطر 457 μm ، وهو 5-10 مره قطر الهيكل التنظيمي التي يتم المصنفة. لنقل وحدات التخزين من 2 مل أو أكبر (علي سبيل المثال ، الخطوات 1.16 و 2.1) ، استخدم الماصات المصلية بأقطار الأطراف الزائدة من 1,500 μm.
  3. حساب كثافة organoid باستخدام المعادلة التالية:
    Equation
    الكثافة المطلوبة هي 1,000 organoids/مل لتبسيط مزيد من التخفيف. إذا كانت الكثافة منخفضه جدا ، الطرد المركزي في 450 x g لمده 5 دقائق والشفط وسائل الاعلام. أضافه وسائل الاعلام اللازمة للوصول إلى 1,000 organoids/مل ، وماصه تماما لخلق خليط متجانس.
    1. لزراعه العضوية في مصفوفة البروتين ، والبذور العضوية في تركيز 1 organoids/لتر في نوع الكولاجين 1 المخفف إلى 87 ٪ أو في غشاء الطابق السفلي المستخرجة من انجلبريث-هولم-سرب ساركوما الماوس. اثناء العمل مع العينات ، والحفاظ علي الجليد.
    2. لتجميد العضو العضوي ، انقل الحجم المطلوب إلى أنبوب طرد مركزي منفصل. تدور في 450 x g لمده 5 دقائق الوسائط التي يستنشق ، ومن ثم أضافه نفس الحجم من 90 ٪/10 ٪ dmso. أعاده التعليق العضوي ، ومن ثم قسامه إلى كريتويبس. نقل إلى-80 درجه مئوية ، ومن ثم إلى النيتروجين السائل في غضون أسبوع واحد.
    3. لذوبان الجليد ، دافئه في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده دقيقه واحده. أجهزه الطرد المركزي في 450 x g لمده 5 دقائق ، ثم يستنشق وسائل الاعلام تجميد. شطف مع DPBS معقمه ، ومن ثم أجهزه الطرد المركزي مره أخرى. الشفط DPBS وأضافه وسائل الاعلام الorganoid.
  4. ماصه 50 μL (50 organoids) في كل بئر من لوحه التصاق منخفضه (الشكل 1I).
  5. أضافه 150 μL من وسائل الاعلام organoid لتحقيق حجم العمل الإجمالي إلى 200 μL. تتكون وسائل الاعلام العضوية من 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين و 1 ٪ الانسولين ترانسفيرين-السيلينيوم (لها) في DMEM/F12 وسائل الاعلام.
  6. كل 2 أيام استبدال وسائل الاعلام بعناية.
    ملاحظه: لوحات التصاق منخفضه ليست ثقافة الانسجه المعالجة ؛ لذلك ، يمكن فصل الخلايا بسهوله. يستنشق وسائل الاعلام ببطء عن طريق أماله لوحه وادراج غيض ماصه علي حافه كل بئر. ترك كميه صغيره من وسائل الاعلام في الجزء السفلي من البئر. أضف وسائل الاعلام الجديدة ببطء لتجنب تطبيق قوي القص غير الضرورية علي الهيكل العضوي.

3. شارك في الخياطة مع الضامة

  1. الحفاظ علي GFP أو dTomato الموسومة الخام 264.7 الضامة في DMEM وسائل الاعلام تستكمل مع 10 ٪ من الطراز الأول و 1 ٪ البنسلين-ستربتوميسين. البذور 1 × 104، 5 × 104، أو 1 × 105 خلايا/مل في وسائل الاعلام organoid.
  2. استخدم التباين في مرحله الخلية الحية والتصوير الفلوري لمراقبه تسلل الضامة مع مرور الوقت.

4. تلطيخ المناعي من organoids

ملاحظه: يمكن ان يكون الملونة Organoids في الآبار التصاق منخفضه أو يمكن نقلها إلى الشرائح الغرفة. للانتقال ، قم بالماصة برفق صعودا وهبوطا حتى تنفصل الصفائح العضوية. نقل إلى الشرائح الغرفة واحتضان ل 4-8 h للسماح organoids للانضمام إلى سطح اللوحة.

  1. أزاله المتوسطة organoid من الآبار عن طريق الشفط بعناية. إصلاح عينات مع 10 ٪ محايده الفورمالين مؤقت لمده 15 دقيقه في RT.
  2. غسل 3x 5 دقيقه في 1x تلفزيوني. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تخزين عينات ثابته في 4 درجه مئوية لمده أسبوع واحد لمزيد من تلطيخ.
  3. بيركابايز مع 0.1 ٪ 4-(1 ، 1 ، 3 ، 3-Tetramايثيل بوتيل) فينيل-البولي إيثيلين جلايكول لمده 5 دقائق.
    ملاحظه: إلى وصمه عار ل F-actin ، احتضان عينات مع phسبائك المخفف 1:1000 و 1.67 nM الصبغة النووية bisbenzimide في 1 ٪ تلفزيوني/بوسنيا لمده 1 ساعة في RT. ثم انتقل إلى الخطوة 4.8.
  4. [برميكابيز] مع 0.5 [ببس]. يمكن تخزين العينات في صور 4opy والصور المناعية. أليات التي تسهم في rlock CTC مع 5 ٪ مصل الماعز العادي في 0.1 ٪ من البلاستيك/البولي إيثيلين جلايكول سوربيتان monolaurate (PBST) لمده 1 ساعة في RT. غسل 3x 5 دقيقه مع تلفزيوني.
  5. احتضان مع المضادة للسيتوكيراتين 14 المخفف 1:1000 ، البريد--Cملتصقون المخفف 1:200 ، أو ضيق مفرق البروتين واحد المخفف 1:100 في 1 ٪ خ ع في PBST لمده 1 ساعة في RT. غسل 3x 5 دقيقه في PBST.
  6. احتضان مع الماعز المضادة للأرنب الثانوية المخفف 1:200 مع 1 ٪ خ ع/PBST ل 1 ح في RT. تغطيه مع إحباط لتجنب التعرض للضوء.
  7. غسل 3x 5 دقيقه في الاذاعه التلفزيونية. استخدام الصبغة النووية (انظر جدول المواد) إلى نوى وصمه عار.
  8. غسل 3x 5 دقيقه في الاذاعه التلفزيونية. إذا كنت تستخدم شريحة الغرفة ، وجبل مع الشفة. تخزين ملفوفه في رقائق في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الحصول بنجاح المشعة الظهاريه الثديية الثدي من الغدد الثديية الماوس ، معالجتها ، ومثقف علي لوحات التصاق منخفضه (الشكل 1). تم اختبار الغلة organoid من قبل البذر في بيئات النمو المختلفة (الشكل 2A-G). خلايا البذر مباشره علي ثقافة الانسجه تعامل 10 سم لوحات الخلية أسفرت عن فرط نمو الخلايا الليفية. تم التعرف علي الخلايا الليفية تحت المجهر علي النقيض من المرحلة في أو بالقرب من نفس المستوي من التركيز كما organoids ، وانها سرعان ما نشات من organoids مطلي في غضون أيام قليله. ولوحظ أيضا نمو في الخلايا الليفية عندما تم البذر العضوي في غشاء الطابق السفلي ومصفوفات بروتين الكولاجين (الشكل 2 هاء ، و).

وتم اختبار مجموعه متنوعة من الظروف في تحسين النمو العضوي المشع (الشكل 2H). تم استخدام أنواع كولاجيناز الأول والثامن من كلوستريديوم histolyticum كانزيم في الخطوة الهضم organoid12،16،17. وكانت غله organoid اعلي بكثير بعد الهضم مع كولاجيناز الثامن. قد يكون هذا بسبب عمليات التنقية المستخدمة في إنتاج الانزيم: نوع كولاجيناز I يتم تنقيته جزئيا وقد يسبب ضررا لا لزوم له للبروتينات والمستقبلات الغشائية ، مما يؤدي إلى التكوين العضوي الضعيف ، تحلل الخلايا ، أو الإفراط في الهضم16 , 17 , 18-ولم يلاحظ وجود فروق كبيره في الغلة بين العضوية المشعة والتحكم العضوي.

يمكن ان تكون مثقفه العضوية المشعة في لوحات التصاق منخفضه (الشكل 3A-C) أو داخل غشاء الطابق السفلي (الشكل3A-G) ، ولكن حدث النمو الأكثر سرعه في لوحات التصاق منخفضه (الشكل3a). [ارغنويدس] لخص ثدييه غده صفه. تشير النصال البيضاء إلى الثوابت المشابهة للقنوات والفصوص19 ،20 ،21 (الشكل3 ج) ، والتي تعتبر حاسمه لإنتاج ونقل الحليب في الغدة الثديية21. غير انه يلزم المزيد من التوصيف لتاكيد هذه الملاحظة. وأشارت اتجاات النمو إلى ان الأحماض العضوية غير المشعة نمت أسرع من العضوية المشعة (الشكل 3H) ، علي الأرجح بسبب القبض علي نمو الخلايا الناتجة عن أليات إصلاح تلف الحمض النووي ؛ بيد ان هذا الاتجاه لم يكن هاما من الناحية الاحصائيه22. ولوحظ تكتل في بعض الأحيان من العضوية المنخفضة التصاق ، ويمكن ان يكون مثقفا organoids تصل إلى أسبوعين قبل انفصام.

وأعرب organoids الخصائص الظهاريه ، والتي تم تقييمها من خلال تلطيخ المناعية للسيتوكيراتين 14 (K14) ، البريد الكتروني (e-cad) ، وضيق تقاطع البروتين 1 (ZO-1)23،24،25 ( الشكل 4). وأعربت organoids المشع علامات الظهاريه. K14 ، وهو علامة من ظهاره العضلي23، وأعرب بقوة علي سطح العضوية المشعة (الشكل 4a). بالاضافه إلى ذلك ، تم التعبير عن E-cad و ZO-1 داخل تقاطعات الخلوية من organoids (الشكل 4b ، C). هذه البروتينات ضرورية للتصاق الخلية السليم24. وبعد التشعيع ، استمرت العضوية في الاحتفاظ بخصائصها الظهاريه.

ويمكن تصور تلطيخ الفلورسنت من organoids داخل لوحات التصاق منخفضه باستخدام المجهر مضان (الشكل 5A-D) ؛ ومع ذلك ، تم الحصول علي أوضح التصور عن طريق المجهر البؤري (الشكل 5E-F). تم حساب كثافة الفلورية الاجماليه المصححة عن طريق طرح الخلفية وتطبيعها بواسطة منطقه organoid (الشكل 5 ز). ينمو [ارغنويدس] في ال [96-ول] التصاق منخفضه لوحات أيضا يسهل [انتي-كلتثر] تجارب. عندما المصنفة في تركيزات نموذجيه في الغدة الثديية ، الضامة شارك في المترجمة مع التحكم والعضوية المشعة (الشكل 6)24،26.

Figure 1
الشكل 1 أسلوب سير العمل. (ا) تم استئصال الغدد الثديية من الفئران. وقد استخدمت الغدد الثديية والبطن الاربيه. (ب) كانت الغدد الثديية المشع في أنابيب الطرد المركزي 50 mL التي تحتوي علي الوسائط dmem/F12. (ج) تم نقل الغدد الثديية إلى لوحات سته جيده معقمه وقطع مع الفروة الجراحية حتى المفروم (D). (ه) تم نقل الغدد الثديية إلى أنابيب الطرد المركزي 50 ml التي تحتوي علي 5 مل من وسائل الاعلام المعقمة Dmem/F12 لكل غده وهضمها في محلول الثامن كولاجيناز (F). (ز) بعد نقلها إلى أنبوب 15 مل ، تم استخدام التمايز الطرد المركزي لأزاله الخلايا اللحمية ، خلايا واحده ، وخلايا الدم الحمراء ، لوحظ في بيليه حمراء (السهم الأبيض الراس) حتى تم الحصول علي العضوي الظهاريه البيضاء فقط (ح ). (ط). 50 وقد تم طلاء organoids في 200 μl من وسائل الاعلام في 96-حسنا منخفضه لوحات التصاق والذين يستخدمون المرحلة المجهر التباين الطور شريط مقياس يمثل 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 الطلاء العضوي في مصفوفات البروتين 3D وعلي الانسجه المعالجة البلاستيكية الثقافة. العضوية المصنفة في الكولاجين (ا) وغشاء الطابق السفلي (ب) ، الذين تتراوح أعمارهم بين 84 ساعة من النمو. وقد حدثت الخلايا الليفية في الهيكل العضوي المطلي بالمصفوفة (C, D). تم الحصول علي صور التباين المرحلة من organoids فرزها من خلال الترشيح 192 ساعات بعد البذر. لم يلاحظ اي فروق رئيسيه بين الترشيح ([ا]) و [رينتريت] ([ف]) كان, مع كلا ينتج في متموج [فيبرونسف] حاله نمو. وقد تم بذر الخلايا في E و F علي الانسجه البلاستيكية المعالجة الثقافة. بعد التريسينزينج لمده 5 دقائق في RT ، تمت أزاله الخلايا الليفية عن طريق الطموح. ومع ذلك ، شكلت الخلايا الظهاريه المتبقية ثقافة أحاديه الطبقة بدلا من العضوية ثلاثية الابعاد (G). القضبان مقياس ل A-G تمثل 100 μm. (ح) أنواع مختلفه كولاجيناز (I (CI) والثامن (cviii)) وأساليب معالجه الخلايا (الترشيح والتفريق الطرد المركزي (الفرق المئوية)) تم اختبارها ، والغلة العضوية في الغدة الثديية كان كميا (ن = 2 الغدد ل CI ، فلتر ؛ 2 الغدد ل CVIII ، فلتر ؛ 4 الغدد لCI ، الفرق المائة ، و 12 الغدد ل CVIII ، الفرق المائة). تم تحديد الاهميه الاحصائيه باستخدام ثنائي الذيل ، غير المقترن اختبار t ، * * * p < 0.0001. تمثل أشرطه الخطا خطا قياسيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 النمو العضوي التمثيلي. صور التباين المرحلة من النمو العضوي المشع في لوحات التصاق منخفضه الحصول علي 20 (ا) ، 44 (ب) ، و 106 (ج) بعد ساعات من البذر. تشير النصال البيضاء إلى الهياكل التي لها شكل مماثل للقنوات والفصوص. صور التباين المرحلة من النمو organoid المشع في غشاء الطابق السفلي الحصول علي 42 (د) ، 66 (ه) ، 60 (و) ، و 114 (ز) بعد ساعات من بذر البذور. تمثل أشرطه المقياس 50 μm. H. تم الحصول علي قياسات المنطقة في ظروف نمو مختلفه: العضوية المصنفة علي الفور بعد الهضم والفرز (المشع (●) ، والتحكم (▪)) ، واللحمية المصنفة في غشاء القبو (المشع (○) ، والسيطرة (□)) (ن = 3 كل الغدد). تم اجراء حسابات المنطقة باستخدام برنامج ImageJ. تمثل أشرطه الخطا خطا قياسيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 التعبير عن العلامة الظهاريه علي Organoids المشع. السيتوكيراتين 14 (K14 ، الأخضر) ، وهو علامة للطبقة القاعدية من الحرشفية وغير الحرشفية ، وأعرب عن العضوية المشعة (a). وأعرب البريد الكتروني (E-Cad) ، وهو البروتين الأساسي للتصاق ، داخل التقاطعات بين الخلايا في العضوية المشعة (ب). ضيقه تقاطع بروتين واحده ([زو-1]) كان أيضا عبر عن داخل خليه تقاطعات من [ارغنويدس] مشعة ([ك]). تم الحصول علي الصور في الشرائح الغرفة عن طريق المجهر البؤري. واستخدمت وصمه الأحماض النووية لتصور نوى (الأزرق). وكانت جميع العضوية ثابته وغير المسنين بعد أسبوع واحد من النمو. قضبان المقياس هي 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 F-actin التعبير في organoids. وقد تم التعبير عن F-actin (الأحمر) ، وهو ميكروخيوط في الخلايا الظهاريه ، مع انخفاض كثافة في العضوية غير المشعة (a ، C ، E) من المشعة (ب ، د ، و) organoids. واستخدمت وصمه الأحماض النووية لتصور نوى (الأزرق). أخذت صور علي التصاق منخفضه 96-بئر لوحات ([ا], [ ب]) و [16-ول] غرفه منزلقات ([ك], [ د]). وأخذت الصور أيضا باستخدام المجهر البؤري (E, F). وكانت جميع العضوية ثابته وغير المسنين بعد أسبوع واحد من النمو. أشرطه المقياس هي 50 μm. G. وقد تم تحديد كميه البيانات الفلورية phسبائك من الصور لوحه التصاق منخفضه في ImageJ (ن = 3 الغدد). تشير أشرطه الخطا إلى الخطا القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 تقييم تفاعلات خلايا الخلية من خلال الثقافة المشتركة بين الضامة والعضوي. الضامة (الحمراء) تسللت السيطرة (ا) والمشع (ب) العضوية العضوي. أشرطه المقياس تمثل 50 μm. تم الإبلاغ عن منطقه متوسط النسبة المئوية من الضامة في حقل الصورة (C) في 24 ساعة من الثقافة المشتركة للسيطرة (الأصفر) والمشع (البرتقالي) العضوي (n = 3 الغدد لكل عينه). تم البذر الضامة في تركيزات 10,000 خلايا/مل ، 50,000 خلايا/مل ، و 100,000 الخلايا/مل ، وتم القبض علي تسللهم كل 30 دقيقه عن طريق التصوير الحي الخلوي. بدات جميع التجارب الثقافية المشتركة بعد 7 أيام من البذر العضوي الاولي. تم تحديد الاهميه الاحصائيه باستخدام ثنائي الذيل ، غير المقترنة اختبار t ، * p < 0.05 ، * * * p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير طريقه لنمو وتوصيف الغدد الثديية المشعة التي يمكن استنساخها (الشكل 1). تم تطبيق جرعه التشعيع من 20 غراي لتعكس السابقة في نماذج الجسم الخارجي من الخلايا السرطانية التوظيف5. تشعيع الغدد الثديية السابقة الجسم العضوي قبل تشكيل organoid يسمح للعزل من اثار الضرر الإشعاعي دون تسلل المقابلة من الخلايا المناعية. تطوير نموذج الانسجه الطبيعية المشعة في المختبر يتيح العرض في الوقت الحقيقي من التفاعلات الخلوية التي قد تسهم في الإشعاع المستحثة CTC التوظيف11,12.

الخطوات التالية عن كثب 1.5-1.18 كانت حاسمه لتعظيم الغلة organoid. وأضافنا الارصفه المذابة من كولاجيناز المركزة إلى الحل الهضمي. نظرا لطبيعة لزجه للغاية من aliquot مركزه كولاجيناز ، يمكن ان يكون هناك بعض الاختلافات في المبلغ ، التالي في النشاط الانزيمي ، لذلك يجب مراقبه الهضم organoid عن كثب لتجنب الإفراط في الهضم. من المهم أيضا ان هضم العضو العضوي في أنبوب 50 mL لان هذا يسمح لمنطقه سطح حتى للهضم. وقد استخدمت دراسات أخرى الترشيح لتنقيه organoids19,23; ومع ذلك ، حصلنا علي تنقيه العائد اعلي بكثير مع التمايز الطرد المركزي (الشكل 2H). والماصات التي تسبق الطلاء ، والأطراف الماصة ، وأنابيب الطرد المركزي المزودة بحل الجيش الصربي ضرورية لتعظيم الغلة. تلتزم العضوية بشكل ملحوظ بالبلاستيك غير المصقول عند إهمال تطبيق المحلول.

يجب توخي الحذر الشديد لتجنب شفط العضو العضوي. هذا هو الخطر الذي يحدث عند تنقيه وتغيير وسائل الاعلام ، وتلطيخ لعلامات الفلورسنت. باستخدام لوحات التصاق منخفضه للنمو يسمح لنقل سهله من العضوية ويزيل الحاجة إلى ان تقسم العضوية في OCT لمزيد من تلطيخ ، وهو الاجراء المطلوب لغشاء القبو جزءا لا يتجزا من organoids11. بالاضافه إلى الفوائد من النمو المتفوق ، البذر العضوي المشع في لوحات التصاق منخفضه المطلوبة خطوات اقل وكان اقل تحديا من الناحية الفنية من الأرغن العضوي في غشاء الطابق السفلي أو الكولاجين. ومع ذلك ، عند تلطيخ للعلامات ، قد يكون من المفيد لعرض العضوية تحت المجهر لضمان عدم حدوث الطموح العرضي.

وعلاوة علي ذلك ، هناك العديد من الاعتبارات التي يجب ان تحسب عند التصوير العضوي. داخل غشاء القبو جزءا لا يتجزا من organoids ، قد يلاحظ نمو الخلايا الليفية في بعض الأحيان (الشكل 2C، D). قد يكون سبب الخلايا الليفية الناتجة عن الخلايا العضوية المستزرعة ثلاثية الابعاد من قبل organoids جعل الاتصال مع ثقافة الانسجه السطحية المعالجة كما التصاق يؤدي إلى اوبريجولاتيد عامل النمو الليفي الإنتاج في خليه ملتصقة27. ومن المثير للاهتمام ، وتشكل هذه الخلايا الليفية مشابهه لافت للنظر إلى ما قبل الخلايا الشحمية كما كل من أنواع الخلية المعرض مغزل ، ممدود الاشكال28. في مزيد من التحقيق ، قد التعرض للانسولين ، ديكساميثازون ، و 3-ايزوبوتيل-1-ميثيلززانيني (IBMX) الغلة الخلايا مع سلاله اديبوغينيك ، تحفيز التحول نحو شكل الخلوية أكثر كرويه المرتبطة الخلايا الشحمية28، 29. حصلنا علي صور واضحة باستخدام المجهر المرحلة النقيض من النمو الحر المنخفض التصاق (الشكل 3a-C) وغشاء الطابق السفلي جزءا لا يتجزا من (الشكل3a-G) organoids. تتبع النمو العضوي الفردي في لوحات التصاق منخفضه ، ومع ذلك ، كان من الصعب بسبب الحد الأدنى من التصاقات البؤرية بين الخلايا وسطح جيدا ، مما ادي إلى حركه organoid والطموح في بعض الأحيان.

مره واحده الملون لعلامات السطح ، المجهر البؤري المقدمة التعريب علامة أكثر وضوحا (الشكل 5E، F) من ويديفيلد المجهر (الشكل5e-D). من القياس الكمي الفلوري ، تشير الاتجاات في التعبير phمسبوكه إلى ان العضوية المشعة أعربت عن زيادة F-actin نسبه إلى السيطرة (الشكل 5G). وقد لوحظت أعاده تنظيم اكتيتن خلوي في الخلايا البطانية الوعائية المجهرية الجلدية المشع في جرعات مماثله30.

لمتواليات التصوير الموسعة ، مثل الفاصل الزمني المشترك الثقافة مع الخلايا المناعية (الشكل 6) ، مطلوب غرفه التصوير الخلية الحية مع الرطوبة و co2 السيطرة31. صور الخلية الحية التي التقطت كل 30 دقيقه كشفت ان الضامة شارك في المترجمة مع organoids بعد 24 ساعة (الشكل 6A، B) ، والهجرة بشكل تفضيلي نحو العضوية المشعة (الرقم6a). وقد لوحظ تسلل الضامة إلى الانسجه العادية المشعة في الجسم الطبيعي ، ويعزي إلى التدرجات chemokine وخلوي ، وعاده ما تسبق التوظيف CTC5. سوف الدراسات المستقبلية تقييم التفاعلات الضامة المنشطة الكلاسيكية وبدلا من ذلك مع organoids المستقطبة ديناميات الضامة قد تلعب دورا هاما في تحديد الاستجابة للإشعاع32,33. ستقيم تحاليل اضافيه نتيجة المجاعة في المصل وأثار النمو الناجمة عن زراعه الخلايا العضوية في وسائل الاعلام الكاملة نظرا لان هذه المتغيرات قد يكون لها تاثيرات كبيره علي تفاعلات الخلية المناعية العضوي. ويمكن أيضا تكييف هذا النظام للثقافة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك خلايا CD8 + T ، والخلايا اللحمية ، والخلايا الشحمية ، وسرطان الثدي. المراقبة في الوقت الحقيقي مع تقنيات مثل التصوير الخلوي الحي سوف تسهل توضيح أليات المحتملة التي تسهم في توظيف لجنه مكافحه الإرهاب إلى الانسجه الطبيعية المشعة ، والتي قد تكون لها اثار كبيره علي المرضي الذين يعانون من المتكررة الاعمال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة لورا ل. Bronsart لتوفير GFP و dTomato-المسمي RAW 264.7 الضامة. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل منحه المعاهد القومية للصحة #R00CA201304.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 147 ، الثقافة العضوية الثلاثية الابعاد ، الغدة الثديية ، الاستجابة الطبيعية للإشعاع النسيجي ، تفاعلات خلايا الخلايا ، سرطان الثدي ، مناعة السرطان
نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hacker, B. C., Gomez, J. D.,… More

Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter