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Bioengineering

स्तन ग्रंथियों से किरणित ऑर्गेनॉयड की वृद्धि और लक्षण वर्णन

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

माउस से विकसित आर्गेनॉइड स्तन ग्रंथियों किरणित और उपकला लक्षण और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत का आकलन विशेषता थे । विकिरणित ऑर्गेनॉइड सेल-सेल इंटरैक्शन का बेहतर मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो किरणित सामान्य ऊतक में ट्यूमर कोशिका भर्ती के लिए नेतृत्व कर सकता है ।

Abstract

पाचन ऊतक से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉयड तीन आयामी (3 डी) constructs कि बेहतर सेल monolayers की तुलना में vivo शर्तों में संक्षेप हैं । हालांकि वे पूरी तरह से vivo में जटिलता मॉडल नहीं कर सकते, वे मूल अंग की कुछ कार्यशीलता को बनाए रखने । कैंसर के मॉडल में, ऑर्गेनॉइड सामांयतः ट्यूमर कोशिका आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सामान्य ऊतकों में विकिरण प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए सामान्य और विकिरणित माउस स्तन ग्रंथि ऊतक से ऑर्गेनॉयड को विकसित और चित्रित करना है । इन ऑर्गेनॉइड विट्रो कैंसर अध्ययन में भविष्य के लिए लागू किया जा सकता है विकिरण ऑर्गेनॉयड के साथ ट्यूमर कोशिका बातचीत का मूल्यांकन । स्तन ग्रंथियों का पुनर्विच्छेदन किया गया, 20 जीवाई के लिए किरणित और एक collagenase आठवीं समाधान में पचा । उपकला ऑर्गेनॉइड केंद्रापसारक विभेदन के माध्यम से अलग थे, और 3 डी ऑर्गेनॉइड ९६ में विकसित-अच्छी तरह से कम आसंजन माइक्रोप्लेट्स थे । ऑर्गेनॉइड विशेषता उपकला मार्कर cytokeratin 14 व्यक्त की है । सह-संस् कृति प्रयोगों में ऑर्गेनॉयड के साथ मैक्रोफेज अन्योन्य क्रिया देखी गई इस मॉडल ट्यूमर-stromal बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ, और एक किरणित microenvironment के भीतर महाविभोजी ध्रुवीकरण.

Introduction

लगभग ६०% ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (टीएनबीसी) के रोगियों के उपचार के एक फार्म के रूप में स्तन संरक्षण चिकित्सा (BCT) का चयन1। इस इलाज के साधन में, स्तन ऊतक के भाग युक्त ट्यूमर को हटा दिया जाता है, और आसपास के सामान्य ऊतक किसी भी अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए विकिरण ionizing के संपर्क में है । उपचार स्तन कैंसर आबादी की बहुत में पुनरावृत्ति कम कर देता है; तथापि, लगभग १३.५% टीएनबीसी अनुभव के साथ रोगियों का इलाज locoregional पुनरावृत्ति2। इसलिए, अध्ययन कैसे विकिरण ट्यूमर कोशिकाओं (ctcs) परिसंचारी भर्ती कर सकते है स्थानीय पुनरावृत्ति3,4में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व करेंगे ।

पिछले काम से पता चला है कि सामांय ऊतक के विकिरण विभिंन प्रकार के सेल की भर्ती बढ़ जाती है5। TNBC के पूर्व नैदानिक मॉडलों में, सामान्य ऊतक के विकिरण में मैक्रोफेज और बाद में सामान्य ऊतकों के लिए ट्यूमर सेल भर्ती में वृद्धि हुई5. प्रतिरक्षा की स्थिति को प्रभावित ट्यूमर कोशिका के लिए भर्ती किरणित साइटों, ट्यूमर कोशिका प्रवास के साथ प्रतिरक्षा विषयों में मनाया । स्तन ग्रंथियों से व्युत्पन्न ऑर्गेनॉयड का उपयोग कर इन बातचीत को पुनः पूंजीकरण माइक्रोस्कोपी और लाइव सेल इमेजिंग के साथ वास्तविक समय में सेल माइग्रेशन और सेल-stromal बातचीत के अवलोकन की अनुमति देगा बदलने में विकिरण क्षति की भूमिका का निर्धारण करने के लिए ट्यूमर सेल व्यवहार ।

माउस स्तन ऑर्गेनॉइड स्तन ग्रंथि के विकास में महत्वपूर्ण कदम स्पष्ट मदद की है । एक स्तन अंगाभ है एक बहु कोशिकीय, तीन आयामी अलग स्तन उपकला है कि ५० μm6,7,8,9,10से बड़ा है का निर्माण । प्राथमिक उपकला ऑर्गेनॉयड का उपयोग करना, सिमियां एट अल. स्तन ग्रंथि में शाखाओं में बंटी के लिए आवश्यक कारकों का मूल्यांकन7. शमिर एट अल. पता चला कि प्रसार मध्योतक संक्रमण के लिए एक उपकला के बिना हो सकता है, मेटास्टेटिक झरना8में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । स्तन ग्रंथि ऊतक से पैदा करने और अभिलक्षणन ऑर्गेनॉइड के लिए तरीके6,11,12,13अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं । तथापि, हमारी जानकारी के लिए, स्तन ग्रंथियों से विकिरणित ऑर्गेनॉयड उगाने के तरीकों की सूचना नहीं दी गई है । विकिरणित ऑर्गेनॉइड के बढ़ने और विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल विकिरण प्रेरित प्रतिरक्षा और ट्यूमर कोशिका भर्ती को पुनः पूंजीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम होगा ।

इस कागज में, हम बढ़ रही है और एक हाइड्रोफिलिक बहुलक है कि spheroids के गठन का समर्थन करता है के साथ लेपित कम आसंजन माइक्रोप्लेट्स में विकिरणित स्तन उपकला ऑर्गेनॉइड की विशेषता के लिए एक विधि की रिपोर्ट । इन ऑर्गेनॉयड प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ कैनेटीक्स की जांच करने के लिए मैक्रोफेज के साथ सह-संस्कारी थे । यह काम वसा कोशिकाओं के साथ सह-culturing ऑर्गेनॉयड शामिल करने के लिए स्तन विशेषताओं, स्तन कैंसर कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिका भर्ती कल्पना करने के लिए, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं को ट्यूमर-प्रतिरक्षा सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । पहले स्थापित प्रोटोकॉल किरणित ऑर्गेनॉयड का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इससे पहले के मॉडलों में स् ममैरी ऑर्गेनॉयड और प्रतिरक्षा कोशिकाओं ने मेटास्टेसिस और प्रसार के तंत्र पर प्रकाश डाला है । डेन्कार्डो एट अल. पाया गया कि सीडी 4 + T कोशिका विनियमन ट्यूमर संबद्ध मैक्रोफेज के एक मेटास्टेटिक फेनोटाइप के स्तन को बढ़ाया14. जैविक विकास के तंत्रों को स्पष्ट करने के लिए सह-संस्कृति मॉडलों का भी प्रयोग किया गया है । Plaks एट अल. के रूप में सीडी 4 + टी कोशिकाओं की भूमिका को स्पष्ट किया स्तन ऑर्गेनोजेनेसिस के नियामकों15। हालांकि, हमारे समूह को visualizing कैसे सामांय ऊतक किरणन प्रतिरक्षा सेल व्यवहार को प्रभावित करता है की एक प्रक्रिया स्थापित करने के लिए पहली बार है । क्योंकि सामांय ऊतक विकिरण ट्यूमर सेल भर्ती5को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल और आगे का विश्लेषण कैसे ट्यूमर कोशिका व्यवहार सामांय ऊतक और कोशिकाओं के विकिरण से बदल रहा है विकसित किया जा सकता है, की एक बड़ी समझ के लिए अग्रणी कैंसर पुनरावृत्ति ।

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Protocol

पशु अध्ययन संस्थागत दिशा निर्देशों और Vanderbilt विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया ।

1. चूहों और सेल अधिग्रहण की तैयारी (गुयेन-Ngoc एट अल11से अनुकूलित)

  1. एथाइमिक Nu/Nu चूहों (8-10 सप्ताह पुराने) का उपयोग कर2 asphyxiation और उसके बाद ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा । ७०% इथेनॉल का उपयोग कर त्वचा को साफ करें ।
  2. पूर्व निष्फल कैंची और संदंश का उपयोग चूहों से पेट और वंक्षण स्तन ग्रंथियों resect. लकीर से पहले लिम्फ नोड्स निकालें । बाँझ 1x फॉस्फेट buffered खारा (PBS) (चित्र 1a) में कुल्ला ।
  3. यह Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें//पोषक मिश्रण F12 (DMEM/ नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा जा सकता है या तुरंत संसाधित । बर्फ पर रखें ।
  4. सीजियम स्रोत का उपयोग करते हुए 20 जीवाई में नमूनों को विकिरणित करना (चित्र 1बी) ।
  5. ४५ मिनट विकिरण के बाद, एक ३५ मिमी बाँझ कोशिका प्लेट में स्तन ग्रंथियों जगह और सर्जरी के साथ कीमा (चित्र 1c, D) । लगभग ४० स्ट्रोक के साथ कीमा बनाया हुआ जब तक ऊतक आराम और टुकड़े प्राप्त कर रहे है कि कोई बड़ा क्षेत्र में लगभग 1 मिमी2 से हैं ।
  6. एक ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में collagenase समाधान करने के लिए स्थानांतरण । Collagenase समाधान के होते है 2 मिलीग्राम/एमएल collagenase ( सामग्री की तालिकादेखें), 2 मिलीग्राम/एमएल trypsin, 5% v/v भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs), 5 Μg/एमएल इंसुलिन, और ५० Μg/एमएल जेंटॅमाइसिन Dmem/F12 मीडिया में । माउस प्रति 10 मिलीलीटर collagenase समाधान का उपयोग करें ।
  7. ३७ ° c पर एक पानी स्नान में प्लेस, 30-60 मिनट के लिए हर 10 मिनट vortexing. पाचन पूर्ण है जब collagenase समाधान बादल है (चित्रा 1E, F) ।
  8. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए ४५० x g पर पचा समाधान नीचे स्पिन । तीन लेयर का अवलोकन किया जाएगा । सुपरनेटंट वसा से बना है, मध्य परत एक जलीय घोल है, और नीचे एक गोली है । गोली लाल दिखाई देगा के रूप में यह उपकला कोशिकाओं का एक मिश्रण है, व्यक्तिगत stromal कोशिकाओं, और लाल रक्त कोशिकाओं (चित्रा 1G).
  9. Precoat सभी pipettes, पिपेट युक्तियां, और गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) समाधान के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों संपर्क करने से पहले । बीएसए समाधान डलबेस्को के फॉस्फेट बफर नमकीन (डीपीबीएस) में २.५ डब्ल्यू/वी प्रतिशत बीएसए होते हैं । पूर्व कोटिंग के लिए, बस फिर पिपेट टिप और ट्यूबों के अंदर करने के लिए बीएसए समाधान निकालें जोड़ें । बीएसए समाधान reused किया जा सकता है, हालांकि यह बाँझ प्रत्येक प्रयोग से पहले फ़िल्टर किया जाना चाहिए ।
  10. अतिरिक्त वसूली के लिए, supernatant एक ताजा BSA लेपित 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण । पिपेट ऊपर और नीचे तेजी से वसा परत फैलाने के लिए । ४५० x g पर अपकेंद्रित्र RT. Supernatant में 10 मिनट के लिए, एक छोटे से ट्यूब में मीडिया की राशि छोड़ने के लिए सेल गोली aspirate से बचने के लिए ।
  11. मूल गोली के साथ ट्यूब से जलीय परत aspirate.
  12. मूल गोली और दूसरी ट्यूब के हस्तांतरण के साथ ट्यूब के लिए DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट दो छर्रों को संयोजित करने और पुन: निलंबित करने के लिए तेजी से.
  13. ४५० x g पर अपकेंद्रित्र RT. Supernatant पर 10 मिनट के लिए और dmem के 4 मिलीलीटर जोड़ें/
  14. निलंबन के लिए deoxyribonuclease (DNase) के ४० μL जोड़ें और धीरे हाथ से मिलाने पर 2-5 मिनट के लिए आरटी. DNase समाधान में DMEM/F12 में 4 U/एमएल DNase होते हैं ।
  15. Dmem/F12 और पिपेट के 6 मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ें । ४५० x g पर RT पर 10 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र ।
  16. अधिमहाप्राण ०.५ मिलीलीटर के निशान को सुपरनेटंट । Dmem/F12 और पिपेट के 10 मिलीलीटर में अच्छी तरह से निलंबित ।
  17. ४५० एक्स जी करने के लिए पल्स और उस गति तक पहुँचने के बाद 4 एस बंद करो ।
  18. चरणों को दोहराएं 1.16-1.17 तीन अधिक बार केंद्रापसारक विभेदन के माध्यम से ऑर्गेनॉइड शुद्ध करने के लिए । गोली अब एक बंद सफेद केवल उपकला ऑर्गेनॉइड से मिलकर रंग होना चाहिए (चित्रा 1H) ।
    नोट: Organoids भी बाँझ मेष ४० μm फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर किया जा सकता है । कदम १.१६ के बाद, पिपेट एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक फिल्टर के माध्यम से ऑर्गेनॉइड युक्त मीडिया, और फिर dmem के 5 से 10 मिलीलीटर के साथ कुल्ला/ एक नए ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पर फिल्टर फ्लिप । के माध्यम से DMEM के 10 मिलीलीटर/पास, किसी भी retentate कुल्ला करने के लिए विपरीत रास्ता जा रहा है । रेटिन्टेट ऑर्गेनॉयड से मिलकर होना चाहिए, और छानना मुख्य रूप से stromal कोशिकाओं से मिलकर होना चाहिए, जिसे छोड़ दिया जा सकता है या अगर वांछित रखा ।

2. निर्धारण घनत्व और चढ़ाना ऑर्गेनॉइड

  1. DMEM/F12 के 10 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित । पिपेट अच्छी तरह से एक समरूप समाधान बनाने के लिए ।
  2. स्थानांतरण ५० μL एक 30 मिमी पेट्री डिश के लिए, और 20x पर एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत देखें । एक टैली काउंटर के साथ ऑर्गेनॉयड की संख्या गिनती ।
    नोट: यहां पिपेट युक्तियां लगातार ४५७ μm है, जो 5-10 है ऑर्गेनॉइड कि वरीयता प्राप्त कर रहे है व्यास के एक ंयूनतम व्यास के साथ प्रयोग किया गया है । 2 मिलीलीटर या बड़े (जैसे, कदम १.१६ और २.१) की मात्रा स्थानांतरित करने के लिए, टिप व्यास के १,५०० μm से अधिक के साथ सीरम विज्ञानी पिपेट का उपयोग करें ।
  3. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर अंगाभ घनत्व की गणना:
    Equation
    वांछित घनत्व १,००० ऑर्गेनॉयड/एमएल है । यदि घनत्व बहुत कम है, ४५० x g पर 5 मिनट और महाप्राण मीडिया के लिए केंद्राभ । एक समरूप मिश्रण बनाने के लिए १,००० ऑर्गेनॉयड/एमएल, और पिपेट अच्छी तरह से पहुंचने के लिए आवश्यक मीडिया जोड़ें ।
    1. एक प्रोटीन मैट्रिक्स में ऑर्गेनॉयड विकसित करने के लिए, 1 organoids की एकाग्रता पर बीज ऑर्गेनॉइड/L कोलेजन प्रकार में 1 पतला ८७% या तहखाने से निकाली गई झिल्ली में Engelbreth-Holm-झुंड माउस सार्कोमा । नमूनों के साथ काम करते समय बर्फ पर रखें ।
    2. ऑर्गेनॉइड फ्रीज करने के लिए, एक अलग अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए वांछित मात्रा हस्तांतरण । 5 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर नीचे स्पिन मीडिया, और फिर ९०% fbs की एक ही मात्रा जोड़ें/ पुनः निलंबित ऑर्गेनॉइड, और फिर एक साथ cryotubes में aliquot । करने के लिए स्थानांतरण-८० ° c, और फिर एक सप्ताह के भीतर तरल नाइट्रोजन के लिए ।
    3. गल करने के लिए, एक मिनट के लिए ३७ ° c जल स्नान में गर्म 5 मिनट के लिए ४५० x g पर, और फिर ठंड मीडिया महाप्राण । बाँझ DPBS के साथ कुल्ला, और फिर अपकेंद्रित्र फिर से । महाप्राण dpbs और जोड़ें अंगाभ मीडिया ।
  4. Pipette ५० μL (५० ऑर्गेनॉयड) कम आसंजन थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 1I) ।
  5. कुल कार्यशील वॉल्यूम को २०० μl. अंगाभ मीडिया में लाने के लिए अंगाभ मीडिया के १५० μl जोड़ें 1% पेनिसिलिन के होते है-streptomycin और 1% इंसुलिन-transferrin-सेलेनियम (ITS) dmem/F12 मीडिया में ।
  6. हर 2 दिन मीडिया को ध्यान से बदलें ।
    नोट: कम आसंजन प्लेटें ऊतक संस्कृति का इलाज नहीं कर रहे हैं; इसलिए, कोशिकाओं को आसानी से अलग किया जा सकता है । इस थाली झुकने और प्रत्येक अच्छी तरह से किनारे पर पिपेट टिप डालने के द्वारा धीरे से महाप्राण मीडिया । मीडिया की एक छोटी राशि के कुएं के नीचे में छोड़ दें । नए मीडिया धीरे जोड़ें ऑर्गेनॉइड के लिए अनावश्यक कतरनी बलों को लागू करने से बचने के लिए ।

3. मैक्रोफेजेस के साथ सह-संवर्धन

  1. 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन सहित डीएमईएम मीडिया में जीएफपी या डीटोमैटो-लेबल्ड रॉ २६४.७ मैक्रोफेज को बनाए रखें । बीज 1 x 104, 5 x 104, या 1 x 105 कोशिकाओं/
  2. समय के साथ मैक्रोफेज घुसपैठ की निगरानी के लिए लाइव सेल फेज कंट्रास्ट और फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करें ।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऑर्गेनॉइड का धुंधला होना

नोट: ऑर्गेनॉइड कम आसंजन कुओं में दाग किया जा सकता है या चैंबर स्लाइड को हस्तांतरित किया जा सकता है । स्थानांतरण करने के लिए, धीरे पिपेट ऊपर और नीचे जब तक ऑर्गेनॉइड प्लेटों से अलग है । 4-8 एच के लिए चैंबर स्लाइड्स और सेबेट करने के लिए स्थानांतरण ऑर्गेनॉइड थाली सतह का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए ।

  1. सावधानी से aspirating द्वारा कुओं से अंगाभ माध्यम निकालें । 10% तटस्थ buffered फॉर्मेलिन के साथ 15 मिनट के लिए आरटी में नमूने फिक्स ।
  2. 1x PBS में 3x 5 मिनट धो लें । यदि वांछित, तय नमूनों और धुंधला के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. 5 मिनट के लिए ०.१% 4-(1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) phenyl-पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ permeabilize ।
    नोट: एफ के लिए दाग-actin, 1% PBS में 1 के लिए 1000 और १.६७ एनएम bisbenzimide न्यूक्लियर डाई उसके बाद, चरण ४.८ करने के लिए आगे बढ़ें ।
  4. 0.5 PBS के साथ bermeabilize । नमूने 4opy छवियों और immunoफ्लोरोसेंट छवियों पर संग्रहित किया जा सकता है । तंत्र है कि ०.१% PBS में 5% सामांय बकरी सीरम के साथ CTC rlock के लिए योगदान/PBS के साथ 3x 5 मिनट में 1 एच के लिए Polyethylene ग्लाइकोल sorbitan monolaurate (PBST) ।
  5. विरोधी Cytokeratin के साथ सेक्यूबेट 14 पतला 1:1000, ई Cadherin पतला 1:200, या तंग जंक्शन प्रोटीन एक 1:100
  6. बकरी के साथ सेते-खरगोश माध्यमिक 1% NGS/प्रकाश जोखिम से बचने के लिए पंनी के साथ कवर से 1:200
  7. PBS में 3x 5 मिनट धो लें । नाभिक दाग करने के लिए परमाणु डाई ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
  8. PBS में 3x 5 मिनट धो लें । यदि चैंबर स्लाइड का उपयोग कर, एक coverslip के साथ माउंट । 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंनी में लिपटे स्टोर ।

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Representative Results

विकिरणित उपकला स्तन ऑर्गेनॉयड सफलतापूर्वक माउस स्तन ग्रंथियों, प्रसंस्कृत, और कम आसंजन प्लेटों पर सुसंस्कृत से प्राप्त किया गया (चित्रा 1) । ऑर्गेनोइड उपज का परीक्षण विभिं न विकास परिवेशों में बीजारोपण द्वारा किया गया (चित्र 2a-G) । ऊतक संवर्धन पर सीधे कोशिकाओं बीजारोपण 10 सेमी सेल प्लेट्स फाइबरब्लास्ट कोशिकाओं का एक ऊंचा विकास हुआ । Fibroblasts में या ऑर्गेनॉइड के रूप में ध्यान के एक ही विमान के पास चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के तहत पहचान की थी, और वे जल्दी से कुछ दिनों के भीतर मढ़वाया ऑर्गेनॉयड से बाहर हो गया । जब ऑर्गेनॉयड को तहखाने झिल्ली और कोलेजन प्रोटीन आव्यूहों (चित्र 2E, F) में वरीयता दी गई तो फाइब्रोब्लास्ट का एक बहिर्वृद्धि भी देखा गया ।

स्थितियों की एक किस्म को अनुकूलित अंगाभ वृद्धि में परीक्षण किया गया (चित्रा 2h) । Collagenase प्रकार मैं और 8 क्लॉस्ट्रीडियम histolyticum से अंगाभ पाचन चरण12,16,17में एंजाइम के रूप में इस्तेमाल किया गया । ऑर्गेनोइड पैदावार, कोलेगनेस आठवीं के साथ पाचन के बाद काफी अधिक थी । इस एंजाइम के उत्पादन में इस्तेमाल किया शुद्धि प्रक्रियाओं के कारण हो सकता है: collagenase प्रकार मैं आंशिक रूप से शुद्ध है और झिल्ली प्रोटीन और रिसेप्टर्स के लिए अनावश्यक नुकसान का कारण हो सकता है, गरीब अंगाभ गठन के लिए अग्रणी, सेल lysis, या अधिक पाचन16 , 17 , 18. किरणित और नियंत्रण ऑर्गेनॉइड के बीच उपज में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया ।

विकिरणित ऑर्गेनॉइड कम आसंजन प्लेटों (चित्रा3a-C) या तहखाने झिल्ली के भीतर (चित्रा 3d-G) में सुसंस्कृत हो सकता है, लेकिन सबसे तेजी से वृद्धि कम आसंजन प्लेटों में हुई (चित्रा 3h) । ऑर्गेनॉइड स्तन ग्रंथि विशेषताओं को पुनर्ग्रहण करता है । श्वेत-श्याम के रूप में,19, 20,21 (चित्र 3c), जो स्तन ग्रंथि में दूध के उत्पादन और परिवहन के लिए महत्वपूर्ण हैं हालांकि, इस प्रेक्षण की पुष्टि करने के लिए आगे के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है । विकास के रुझान से पता चला है कि गैर-किरणित ऑर्गेनॉयड तेजी से वृद्धि हुई किरणित ऑर्गेनॉयड (चित्रा 3h), सबसे सेल विकास के कारण डीएनए क्षति की मरंमत के तंत्र से परिणामस्वरूप गिरफ्तारी की संभावना; तथापि, यह प्रवृत्ति सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहींथी । कम आसंजन ऑर्गेनॉयड के सामयिक clumping देखा गया था, और ऑर्गेनॉइड dissociating से पहले दो सप्ताह तक सभ्य किया जा सकता है ।

ऑर्गेनॉयड उपकला विशेषताओं, जो cytokeratin 14 (K14), ई cadherin (ई-सीएडी), और तंग जंक्शन प्रोटीन 1 (ZO-1)23,24,25 ( के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से मूल्यांकन किया गया व्यक्त चित्रा 4) । विकिरणित ऑर्गेनॉइड उपकला मार्करों को व्यक्त करता है । K14, myoepithelium के एक मार्कर, विकिरणित ऑर्गेनॉयड (चित्र 4a) की सतह पर दृढ़ता से व्यक्त किया गया था । इसके अतिरिक्त, E-cad और ZO-1 ऑर्गेनॉइड के सेलुलर जंक्शनों के भीतर व्यक्त किए गए थे (चित्र 4B, C) । इन प्रोटीनों24उपयुक्त सेल आसंजन के लिए आवश्यक हैं । विकिरण के बाद, ऑर्गेनॉइड अपने उपकला विशेषताओं को बनाए रखने के लिए जारी रखा ।

ऑर्गेनॉइड के प्रतिदीप्त धुंधला होने से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कम आसंजन प्लेटों के भीतर कल्पना की जा सकती है (चित्र 5a-D); हालांकि, स्पष्ट दृश्य संनाभि माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5e-F) के माध्यम से प्राप्त किया गया था । संशोधित कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता पृष्ठभूमि को घटाकर और अंगाभ क्षेत्र द्वारा सामान्य (चित्र 5g) की गणना की गई थी । ९६-अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेटों में बढ़ते ऑर्गेनॉयड भी सह संस्कृति प्रयोगों सरलीकृत । जब स्तन ग्रंथि में विशिष्ट सांद्रता में वरीयता प्राप्त, मैक्रोफेज सह नियंत्रण और किरणित ऑर्गेनॉइड के साथ स्थानीयकृत (चित्रा 6)24,26।

Figure 1
चित्रा 1 । पद्धति वर्कफ़्लो । (क) चूहों से स्तन ग्रंथियों का पुनविच्छेदन किया गया । पेट और वंक्षण स्तन ग्रंथियों का इस्तेमाल किया गया । (ख) स्तन ग्रन्थियों को ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में विकिरणित किया गया जिसमें डीएमईएम/F12 मीडिया शामिल हैं । (ग) स्तनग्रंथियों को बंध्य छ-कूप प्लेटों में अंतरित किया गया और उन्हें शल्य चिकित्सीय स्केल्स से काटा गया। (ङ) स्तन ग्रंथियों को ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अंतरित किया गया था जिसमें बाँझ डीएमईएम/ (छ) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित किया जा रहा है के बाद, केंद्रापसारक विभेदन के लिए stromal कोशिकाओं, एकल कोशिकाओं, और लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए उपयोग किया गया था, एक लाल गोली (सफेद तीर सिर) में मनाया जब तक केवल सफेद उपकला ऑर्गेनॉयड प्राप्त किया गया (एच ). (I). ५० ऑर्गेनॉयड ९६-अच्छी तरह से कम आसंजन प्लेटों में मीडिया के २०० μl में चढ़ाया और चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी पैमाने बार का उपयोग कर imaged ५० μm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 । Organoid 3 डी प्रोटीन Matrices में चढ़ाना और ऊतक संस्कृति पर प्लास्टिक का इलाज किया । ऑर्गेनॉयड कोलेजन (ए) और तहखाने झिल्ली (बी) में वरीयता प्राप्त, विकास के ८४ घंटे के बाद imaged । (ग, घ) मैट्रिक्स मढ़वाया ऑर्गेनॉइड में फाइब्रोब्लास्ट की वृद्धि हुई । चरण विस्पंदन के माध्यम से हल ऑर्गेनॉइड के विपरीत छवियों बोने के बाद १९२ घंटे प्राप्त किए गए । छानना (ई) और रेटिन्टनेट (एफ) के बीच कोई मुख्य अंतर नहीं पाया गया, जिसके परिणामस्वरूप दोनों में संकोरक फाइकोब्लास्ट वृद्धि हुई । ई और एफ में कोशिकाओं ऊतक संस्कृति इलाज प्लास्टिक पर वरीयता प्राप्त थे । RT पर 5 मिनट के लिए trypsinizing के बाद, fibroblasts आकांक्षा के माध्यम से हटा दिया गया; हालांकि, शेष उपकला कोशिकाओं एक monolayer संस्कृति के बजाय तीन आयामी ऑर्गेनॉयड (जी) का गठन किया । A-G के लिए स्केल पट्टियां १०० μm का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ज) विभिंन collagenase प्रकार (I (CI) और आठवीं (cviii)) और सेल प्रोसेसिंग विधि (निस्पंदन और केंद्रापसारक विभेदन (प्रतिशत diff)) का परीक्षण किया गया, और स्तन ग्रंथि प्रति अंगाभ उपज था परिमाणित (n = 2 के लिए ग्रंथियों, फिल्टर; CVIII के लिए 2 ग्रंथियों, फिल्टर; CI, प्रतिशत Diff के लिए 4 ग्रंथियों, और CVIII, प्रतिशत Diff के लिए 12 ग्रंथियों) । सांख्यिकीय महत्व एक द्वि-पुच्छ, अयुग्मित t-परीक्षण, * * * p < 0.0001 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 । प्रतिनिधि आर्गेनोइड वृद्धि । (क), ४४ (इ), तथा १०६ (ग) बीजारोपण के घंटे के बाद, निम्न आसंजन प्लेटों में किरणित अंगिका वृद्धि के चरण कंट्रास्ट छवियां । सफ़ेद अर्रोव्हीड उन संरचनाओं को दर्शाते हैं जो नलिकाओं और खण्डों के समान आकारिकी हैं । चरण ४२ (डी), ६६ (ई), ६० (एफ), और ११४ (जी) बोने के घंटे के बाद, तहखाने झिल्ली में किरणित अंगाभ वृद्धि की स्केल पट्टियां ५० μm. H का प्रतिनिधित्व करती हैं । क्षेत्र माप अलग विकास की स्थिति में प्राप्त किए गए थे: ऑर्गेनॉयड तुरंत पाचन और छंटाई (किरणित (●), नियंत्रण (▪)), और तहखाने झिल्ली में वरीयता प्राप्त ऑर्गेनॉइड ((○), नियंत्रण (□) के बाद वरीयता प्राप्त) (n = 3 ग्रंथियों प्रत्येक) । क्षेत्र गणना ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 । विकिरणित ऑर्गेनॉइड पर उपकला मार्कर अभिव्यक्ति । Cytokeratin 14 (K14, हरी), स्क्वैमस और गैर स्क्वैमस उपकला के बेसल परत के लिए एक मार्कर, किरणित ऑर्गेनॉइड (ए) पर व्यक्त किया गया था । E-cadherin (ई-सीएडी), आसंजन के लिए आवश्यक एक प्रोटीन, किरणित ऑर्गेनॉयड में कोशिकाओं के बीच जंक्शनों के भीतर व्यक्त किया गया था (ख) । टाइट जंक्शन प्रोटीन एक (ZO-1) को किरणित ऑर्गेनॉयड (ग) के सेल जंक्शनों के भीतर भी व्यक्त किया गया । संनाभि माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कक्ष स्लाइड्स में छवियां प्राप्त की गई थीं । नाभिक (नीला) को विज़ुअलाइज़ करने के लिए न्यूइक अम्ल दाग़ किया जाता है । सभी ऑर्गेनॉइड स्थिर और वृद्धि के एक सप्ताह के बाद imaged थे । स्केल पट्टियां ५० μm हैं । कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 । ऑर्गेनॉयड में F-actin अभिव्यक्ति । F-actin (लाल), उपकला कोशिकाओं में एक microfilament, विकिरण (बी, डी, एफ) ऑर्गेनॉयड की तुलना में गैर-किरणित ऑर्गेनॉइड (ए, सी, ई) में कम तीव्रता के साथ व्यक्त किया गया था । नाभिक (नीला) को विज़ुअलाइज़ करने के लिए न्यूइक अम्ल दाग़ किया जाता है । छवियां कम आसंजन ९६-कूप प्लेटें (ए, बी) और 16-well चैंबर स्लाइड (सी, डी) पर ले जाया गया । चित्र भी संनाभि माइक्रोस्कोपी (ई, एफ) का उपयोग कर लिया गया । सभी ऑर्गेनॉइड स्थिर और वृद्धि के एक सप्ताह के बाद imaged थे । स्केल बार्स ५० μm. G हैं । कम आसंजन प्लेट छवियों से phalloidin प्रतिदीप्ति डेटा ImageJ में मात्रा (n = 3 ग्रंथियों) थे । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि इंगित करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 । मैक्रोफेज-आर्गेनोइड सह-संस्कृति के माध्यम से कोशिका-कोशिका अंतःक्रियाओं का मूल्यांकन । मैक्रोफेजेस (लाल) घुसपैठ नियंत्रण (ए) और किरणित (ख) ऑर्गेनॉयड । स्केल पट्टियां ५० μm का प्रतिनिधित्व करती हैं । छवि फ़ील्ड (C) में मैक्रोफेज के औसत प्रतिशत क्षेत्र को नियंत्रण (पीला) और किरणित (नारंगी) ऑर्गेनॉयड (n = 3 ग्रंथियों प्रत्येक नमूने के लिए) के लिए सह-संस्कृति के 24 घंटे में सूचित किया गया था । मैक्रोफेज १०,००० कोशिकाओं/एमएल, ५०,००० कोशिकाओं/एमएल, और १००,००० कोशिकाओं/एमएल के सांद्रता में वरीयता प्राप्त किया गया था, और उनकी घुसपैठ लाइव सेल फ्लोरोसेंस इमेजिंग के माध्यम से हर 30 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था । प्रारंभिक आर्गेनोइड सीडिंग के 7 दिन बाद सभी सह-संस्कृति प्रयोग शुरू हुए । सांख्यिकीय महत्व एक द्वि-पुच्छ, अयुग्मित t-परीक्षण, * p < 0.05, * * * p < 0.0001 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने पुनरुद्देशणीय विकास और विकिरणित स्तन ऑर्गेनॉइड के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि विकसित की है (चित्र 1) । 20 Gy के एक विकिरण खुराक ट्यूमर सेल भर्ती5के vivo मॉडल में पिछले दर्पण के लिए लागू किया गया था । प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक इसी घुसपैठ के बिना विकिरण क्षति प्रभाव के अलगाव के लिए अनुमति दी अंगाभ गठन से पहले स्तन ग्रंथियों के विकिरण पूर्व vivo । एक इन विट्रो के विकास सामान्य ऊतक मॉडल में सक्षम बनाता है वास्तविक समय सेलुलर बातचीत के देखने के लिए प्रेरित ctc भर्ती11,12विकिरण में योगदान कर सकते हैं.

अंगाभ उपज को अधिकतम करने के लिए 1.5-1.18 चरणों का बारीकी से पालन महत्वपूर्ण था । हम पाचन समाधान करने के लिए केंद्रित collagenase के thawed aliquots जोड़ा । केंद्रित collagenase aliquot की अत्यधिक चिपचिपा प्रकृति के कारण, वहां राशि में कुछ बदलाव और एंजाइमी गतिविधि में इसलिए हो सकता है, तो अंगाभ पाचन बारीकी से अधिक पाचन से बचने के लिए निगरानी की जानी चाहिए । यह भी एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में ऑर्गेनॉइड पचाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह पाचन के लिए एक भी सतह क्षेत्र के लिए अनुमति देता है । अंय अध्ययनों को शुद्ध ऑर्गेनॉयड19,23के लिए छानने का काम किया है; तथापि, हम एक बहुत उच्च केंद्रापसारक भिंनता के साथ शुद्ध उपज प्राप्त (चित्रा 2H) । पूर्व कोटिंग pipettes, पिपेट युक्तियां, और बीएसए समाधान के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों उपज अधिकतम करने के लिए आवश्यक है । जब समाधान आवेदन की उपेक्षा की जाती है तो ऑर्गेनॉइड बिना लेपित प्लास्टिक का पालन करते हैं ।

महान देखभाल को aspirating ऑर्गेनॉइड से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । यह एक जोखिम है कि तब होता है जब शुद्ध, मीडिया बदलने, और फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए धुंधला । विकास के लिए कम आसंजन प्लेटों का उपयोग ऑर्गेनॉइड के आसान हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है और ऑर्गेनॉइड के लिए की जरूरत है और अधिक धुंधला के लिए अक्टूबर में sectioned होने के लिए निकालता है, एक प्रक्रिया तहखाने के लिए आवश्यक है एंबेडेड organoids11। बेहतर विकास से लाभ के अलावा, कम आसंजन प्लेटों में किरणित ऑर्गेनॉयड बोने कम कदम की आवश्यकता है और कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण था तहखाने झिल्ली या कोलेजन में संवर्धन ऑर्गेनॉयड । हालांकि, जब मार्कर के लिए धुंधला, यह एक खुर्दबीन के नीचे ऑर्गेनॉइड देखने के लिए उपयोगी हो सकता है सुनिश्चित करने के लिए कि दुर्घटना आकांक्षा उत्पंन नहीं करता है ।

इसके अलावा, वहां कई विचार है कि जब इमेजिंग ऑर्गेनॉइड के लिए जिंमेदार होना चाहिए रहे हैं । बेसमेंट झिल्ली एम्बेडेड ऑर्गेनॉइड के भीतर, सामयिक फाइकोब्लास्ट वृद्धि मनाया जा सकता है (चित्र 2c, डी) । 3 डी सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड में फाइकोब्लास्ट आउटग्रोथ के कारण हो सकता है ऑर्गेनॉयड ऊतक संस्कृति के साथ संपर्क बनाने के साथ जुड़े सतह का इलाज किया दिलचस्प है, इन फाइब्रोब्लास्ट की आकृति strikingly पूर्व के समान है-adipocytes के रूप में दोनों सेल प्रकार का प्रदर्शन पतली, लम्बी आकार28. आगे की जांच में, इंसुलिन के संपर्क में, dexamethasone, और 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) एक adipogenic वंश के साथ कोशिकाओं उपज हो सकता है, एक और अधिक गोलाकार सेलुलर आकार की ओर एक बदलाव के लिए प्रेरित करने adipocytes28, 29. हम मुक्त विकसित कम आसंजन के चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर स्पष्ट छवियों प्राप्त (चित्रा 3a-C) और तहखाने झिल्ली एम्बेडेड (चित्रा 3d-G) ऑर्गेनॉयड. कम आसंजन प्लेटों में व्यक्तिगत अंगाभ वृद्धि ट्रैकिंग, तथापि, कोशिकाओं और अच्छी तरह से सतह के बीच ंयूनतम फोकल चिपकने के कारण मुश्किल था, अंगाभ आंदोलन और सामयिक आकांक्षा में जिसके परिणामस्वरूप ।

एक बार सतह मार्करों के लिए दाग, संनाभि माइक्रोस्कोपी प्रदान की स्पष्ट मार्कर स्थानीयकरण (चित्रा5e, F) से widefield माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5a-D). फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन से रुझान phalloidin अभिव्यक्ति का सुझाव है कि विकिरणित ऑर्गेनॉयड वृद्धि हुई एफ-actin नियंत्रण के सापेक्ष (चित्र 5g) । ऐक्टिन साइटोकंकाल का पुनर्गठन त्वचीय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में देखा गया है, जो इसीप्रकार के खुराकों पर विकिरणित होती है ।

विस्तारित इमेजिंग दृश्यों के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ समय चूक सह संस्कृति की तरह (चित्रा 6), एक जीवित सेल इमेजिंग कक्ष आर्द्रता और सीओ2 नियंत्रण के साथ31आवश्यक है । हर 30 मिनट में ली गई लाइव सेल छवियों से पता चला कि मैक्रोफेज 24 घंटे के बाद ऑर्गेनॉयड के साथ सह-स्थानीयकृत (चित्र 6a, B), अधिमान्य रूप से किरणित ऑर्गेनॉयड की ओर पलायन (चित्र 6c) । विकीर्ण सामान्य ऊतक में मैक्रोफेज घुसपैठ का कारण वीवो में देखा गया है, यह chemokine और साइटोकाइन ग्रेडिएंट के लिए जिम्मेदार है और आमतौर पर सीटीसी भर्ती5के बाद होता है । भविष्य के अध्ययनों का मूल्यांकन करेंगे प्रतिष्ठित और वैकल्पिक रूप से सक्रिय महाविभोजी आर्गेनॉइड के साथ बातचीत polarized महाविभोजी गतिशीलता विकिरण के लिए प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है के रूप में३२,३३. अतिरिक्त विश्लेषण सीरम भुखमरी के परिणाम का मूल्यांकन और पूरा मीडिया में संवर्धन ऑर्गेनॉयड के विकास प्रभाव होगा क्योंकि इन चर organoids पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है-प्रतिरक्षा सेल बातचीत । इस प्रणाली को और अधिक सीडी 8 + T कोशिकाओं, stromal कोशिकाओं, adipocytes, और स्तन कैंसर की कोशिकाओं सहित अन्य कोशिका प्रकार के साथ, सह संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । लाइव सेल इमेजिंग जैसी तकनीकों के साथ रीयल-टाइम अवलोकन से संभावित तंत्र के स्पष्ट होने की सुविधा होगी जो सामान्य ऊतकों को विकिरणित करने के लिए सीटीसी भर्ती में योगदान करता है, जो आवर्ती से पीड़ित रोगियों के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है टीएनबीसी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम GFP और Dटमॅटो लेबल कच्चे २६४.७ macrophages प्रदान करने के लिए Dr. लौरा एल Bronsart धंयवाद । इस शोध को एनआईएच ग्रांट #R00CA201304 ने आर्थिक रूप से सहारा दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

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References

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