Vekst og karakterisering av bestrålt Organoids fra Brystkjertler
Summary
Organoids utviklet fra mus melkekjertlene var bestrålt og preget til å vurdere epitel trekk og interaksjoner med immunceller. Bestrålt organoids kan brukes til å bedre evaluere celle-celle interaksjoner som kan føre til tumor celle rekruttering i bestrålt normalt vev.
Abstract
Organoids avledet fra fordøyd vevet er flercellede tredimensjonale (3D) konstruksjoner som bedre recapitulate in vivo forhold enn celle monolagere. Selv om de ikke kan helt modell in vivo kompleksitet, beholder de noe funksjonalitet i det opprinnelige organet. I kreft modeller, organoids er ofte brukt til å studere tumor celle invasjon. Denne protokollen har som mål å utvikle og karakterisere organoids fra normal og bestrålt mus melke kjertel vev å evaluere strålingen respons i normalt vev. Disse organoids kan anvendes på fremtidige in vitro kreft studier for å evaluere tumor celle interaksjoner med bestrålt organoids. Melkekjertlene ble resected, bestrålt til 20 gy og fordøyd i en kollagenase VIII-løsning. Epitel organoids ble separert via sentrifugal differensiering, og 3D-organoids ble utviklet i 96-brønn lav vedheft mikroplater. Organoids uttrykte den karakteristiske epitel markøren cytokeratin 14. Macrophage interaksjon med organoids ble observert i co-kultur eksperimenter. Denne modellen kan være nyttig for å studere tumor-stromal interaksjoner, infiltrasjon av immunceller, og macrophage polarisering innenfor en bestrålt mikromiljøet.
Introduction
Omtrent 60% av de trippel negative brystkreft (TNBC) pasienter velger bryst-bevaring terapi (BCT) som en form for behandling1. I denne behandlingen modalitet, svulsten som inneholder en del av brystvevet er fjernet, og det omkringliggende normalt vev utsettes for ioniserende stråling å drepe noen gjenværende tumorceller. Behandling reduserer gjentakelse i store deler av brystkreft populasjonen; men ca 13,5% av behandlede pasienter med TNBC erfaring locoregional gjentakelser2. Derfor studerer hvordan stråling kan rekruttere sirkulerende tumorceller (CTC) vil føre til viktig innsikt i lokale gjentakelse3,4.
Tidligere arbeid har vist at stråling av det normale vevet øker rekrutteringen av ulike celletyper5. I pre-kliniske modeller av TNBC, bestråling av normalt vev økt macrophage og senere tumor celle rekruttering til normal vev5. Immun status påvirket tumor celle rekruttering til bestrålt områder, med tumor celle migrasjon observert i immunsupprimerte. Recapitulating disse interaksjoner bruker organoids avledet fra brystkjertler vil tillate observasjon av celle migrasjon og celle-stromal interaksjoner i sanntid med mikroskopi og live celle Imaging å bestemme rollen av stråling skade i endring tumor celle atferd.
Mus melke organoids har hjulpet belyse viktige trinn i utviklingen av melkekjertlene. En bryst organoid er en flercellede, tredimensjonal konstruksjon av isolert bryst epitel som er større enn 50 μm6,7,8,9,10. Ved bruk av primær epitel organoids, Simian et al. evaluert nødvendige faktorer for forgrening i melkekjertlene7. Shamir et al. oppdaget at formidling kan skje uten et epitel til mesenchymal overgang, gir innsikt i metastatisk Cascade8. Metoder for generering og karakteriserer organoids fra melke kjertel vevet er godt etablert6,11,12,13. Imidlertid, å våre kunnskap, metoder for voksing bestrålt organoids fra bryst kjortelen ha ikke blitt rapportere. En protokoll for dyrking og karakteriserer bestrålt organoids ville være et kritisk skritt i recapitulating stråling-indusert immun-og tumor celle rekruttering.
I denne utredningen, rapporterer vi en metode for dyrking og karakteriserer bestrålt bryst epitel organoids i lav vedheft mikroplater belagt med en hydrofile polymer som støtter dannelsen av spheroids. Disse organoids var co-kultivert med makrofager for å undersøke immun celle infiltrasjon Kinetics. Dette arbeidet kan utvides til å omfatte co-dyrking organoids med fett celler å recapitulate melke egenskaper, brystkreftceller for å visualisere tumor celle rekruttering, og CD8 + T-celler for å studere tumor-immun celle interaksjoner. Tidligere etablerte protokoller kan brukes til å evaluere bestrålt organoids. Tidligere modeller co-dyrking bryst organoids og immunceller har belyse mekanismer for metastasering og formidling. DeNardo et al. fant at CD4 + T celle regulering av tumor tilknyttede makrofager forbedret en metastatisk fenotype av bryst adenocarcinomas14. Co-kultur modeller har også blitt brukt til å belyse mekanismer for biologisk utvikling. Plaks et al. avklart rolle CD4 + T celler som ned-regulatorer av bryst organogenesen15. Men vår gruppe er den første til å etablere en prosedyre for å visualisere hvordan normal vev bestråling påvirker immun celle atferd. Fordi normal vev bestråling har vist seg å forbedre tumor celle rekruttering5, kan denne protokollen utvikles videre for å analysere hvordan tumor celle atferd er endret ved bestråling av normalt vev og celler, som fører til en større forståelse av kreft tilbakefall.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen har vi utviklet en metode for reproduserbar vekst og karakterisering av bestrålt melke organoids (figur 1). En bestråling dose av 20 gy ble brukt til speilet tidligere in vivo modeller av tumor celle rekruttering5. Bestråling av brystkjertler ex vivo før organoid dannelse tillatt for isolering av strålings skade effekter uten en tilsvarende infiltrasjon av immunceller. Utviklingen av en in vitro bestrålt normal vev modell muliggjør sanntids …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Laura L. Bronsart for å gi GFP og dTomato-merket RAW 264,7 makrofager. Denne forskningen ble økonomisk støttet av NIH stipend #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
