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Bioengineering

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Abstract

Los organoides derivados del tejido digerido son construcciones tridimensionales (3D) multicelulares que mejor recapitulan las condiciones in vivo que las monocapas celulares. Aunque no pueden modelar completamente la complejidad in vivo, conservan alguna funcionalidad del órgano original. En los modelos de cáncer, los organoides se utilizan comúnmente para estudiar la invasión de células tumorales. Este protocolo tiene como objetivo desarrollar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias de ratones irradiados y normales para evaluar la respuesta a la radiación en los tejidos normales. Estos organoides se pueden aplicar a futuros estudios de cáncer in vitro para evaluar las interacciones de células tumorales con organoides irradiados. Las glándulas mamarias fueron reeliminadas, irradiadas a 20 GY y digerida en una solución de colagenasa VIII. Los organoides epiteliales fueron separados a través de la diferenciación centrífuga, y los organoides 3D fueron desarrollados en microplacas de baja adherencia de 96-well. Los organoides expresaron el característico marcador epitelial citoqueratina 14. La interacción de los macrófagos con los organoides se observó en experimentos de co-cultivo. Este modelo puede ser útil para estudiar interacciones tumor-stromal, infiltración de células inmunitarias y polarización de macrófagos dentro de un microambiente irradiado.

Introduction

Aproximadamente el 60% de los pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) eligen la terapia de conservación de mamas (BCT) como forma de tratamiento1. En esta modalidad de tratamiento, se extrae el tumor que contiene parte del tejido mamario y el tejido normal circundante se expone a la radiación ionizante para eliminar las células tumorales residuales. El tratamiento reduce la recurrencia en gran parte de la población de cáncer de mama; sin embargo, aproximadamente el 13,5% de los pacientes tratados con TNBC experimentan recurrencias locoregionales2. Por lo tanto, estudiar cómo la radiación puede reclutar células tumorales circulantes (CTCS) dará lugar a información importante sobre la recurrencia local3,4.

El trabajo anterior ha demostrado que la radiación del tejido normal aumenta el reclutamiento de varios tipos de células5. En los modelos preclínicos de TNBC, la irradiación del tejido normal aumentó el macrófago y posteriormente el reclutamiento de células tumorales a los tejidos normales5. El estado inmune influyó en el reclutamiento de células tumorales en sitios irradiados, con migración de células tumorales observadas en sujetos inmunodeprimido. La recapitulación de estas interacciones utilizando organoides derivados de glándulas mamarias permitirá la observación de la migración celular y las interacciones celular-stromal en tiempo real con la microscopía y las imágenes de células vivas para determinar el papel del daño por radiación en la alteración comportamiento de las células tumorales.

Los organoides mamarios de ratones han ayudado a aclarar los pasos clave en el desarrollo de la glándula mamaria. Un organoide mamario es una construcción tridimensional multicelular de epitelio mamario aislado que es más grande que 50 μm6,7,8,9,10. Utilizando los organoides epiteliales primarios, Simian y otros evaluaron los factores necesarios para la ramificación en la glándula mamaria7. Shamir y otros descubrieron que la diseminación puede ocurrir sin un epitelio a la transición mesenquimal, proporcionando una visión de la cascada metastásica8. Los métodos para generar y caracterizar los organoides del tejido de las glándulas mamarias están bien establecidos6,11,12,13. Sin embargo, según nuestro conocimiento, no se han notificado métodos para cultivar organoides irradiados a partir de glándulas mamarias. Un protocolo para cultivar y caracterizar los organoides irradiados sería un paso crítico en la recapitulación del reclutamiento inmunológico inducido por radiación y de células tumorales.

En este documento, se informa de un método para cultivar y caracterizar los organoides epiteliales mamarios irradiados en microplacas de baja adherencia recubiertas con un polímero hidrófilo que apoya la formación de esferoides. Estos organoides fueron cocultivados con macrófagos para examinar la cinética de infiltración de células inmunitarias. Este trabajo se puede ampliar para incluir organoides de coculturación con células adiposas para recapitular características mamarias, células de cáncer de mama para visualizar el reclutamiento de células tumorales, y las células T CD8 + para estudiar las interacciones de células inmunes del tumor. Se pueden utilizar protocolos previamente establecidos para evaluar los organoides irradiados. Los modelos anteriores que coculturan los organoides mamarios y las células inmunitarias han arrojar luz sobre los mecanismos de metástasis y diseminación. DeNardo y otros descubrieron que la regulación de linfocitos T CD4 + de los macrófagos asociados al tumor mejoró un fenotipo metastásico de adenocarcinomas mamarios14. También se han utilizado modelos de cocultivo para dilucidar los mecanismos de desarrollo biológico. Plaks et al. aclaró el papel de las células T CD4 + como reguladores de la organogénesis mamaria15. Sin embargo, nuestro grupo es el primero en establecer un procedimiento para visualizar cómo la irradiación del tejido normal influye en el comportamiento de las células inmunes. Debido a que se ha demostrado que la irradiación del tejido normal mejora el reclutamiento de células tumorales5, este protocolo se puede desarrollar aún más para analizar cómo el comportamiento de las células tumorales se altera por la irradiación del tejido y las células normales, lo que conduce a una mayor comprensión de recurrencia del cáncer.

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Protocol

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y protocolos aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Vanderbilt.

1. preparación de ratones y adquisición celular (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.11)

  1. Sacrificar ratones nu/nu atímicos (8-10 semanas de edad) usando asfixia por Co2 seguida de luxación cervical. Limpie la piel con etanol al 70%.
  2. Resect las glándulas mamarias abdominales e inguinales de los ratones utilizando tijeras y fórceps preesterilizados. Extirpar los ganglios linfáticos antes de la resección. Enjuagar en solución salina amortiguada de 1x fosfato estéril (PBS) (figura 1A).
  3. Colóquelo en tubos de 15 mL con 10 mL de la mezcla de medios y nutrientes modificados Eagle de Dulbecco F12 (DMEM/F12) para el transporte. Las muestras se pueden mantener durante la noche a 4 ° c o procesarse inmediatamente. Sigue con hielo.
  4. Irradiar muestras a 20 GY utilizando una fuente de cesio (figura 1B).
  5. 45 min después de la irradiación, colocar las glándulas mamarias en una placa celular estéril de 35 mm y picar con escalpelos (figura 1C, D). Mince con aproximadamente 40 golpes hasta que el tejido se relaja y se obtienen piezas que no son más grandes que aproximadamente 1 mm2 en el área.
  6. Transferencia a la solución de colagenasa en un tubo de centrifugación de 50 mL. La solución de collagenasa consiste en 2 mg/mL de colagenasa (ver tabla de materiales), 2 mg/ml de tripsina, 5% v/v suero bovino fetal (FBS), 5 μg/ml de insulina y 50 μg/ml de gentamicina en medios DMEM/F12. Utilice una solución de colagenasa de 10 mL por ratón.
  7. Colocar en un baño de agua a 37 ° c, vórtex cada 10 min para 30-60 min. la digestión se completa cuando la solución de colagenasa está turbia (Figura 1E, F).
  8. Gire hacia abajo la solución digerida a 450 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Se observarán tres capas. El sobrenadante está compuesto de grasa, la capa media es una solución acuosa, y la parte inferior es un pellet. El pellet aparecerá de color rojo, ya que es una mezcla de células epiteliales, células estrales individuales y glóbulos rojos (figura 1g).
  9. Precapa todas las pipetas, puntas de piletas y tubos de centrifugación con la solución de albúmina sérica bovina (BSA) antes del contacto. La solución de BSA consiste en 2,5 w/v% BSA en el fosfato amortiguado de Dulbecco (DPBS). Para el recubrimiento previo, basta con añadir a continuación, retire la solución de BSA en el interior de la punta de la Piera y tubos. La solución de BSA se puede reutilizar, aunque debe filtrarse estéril antes de cada experimento.
  10. Para la recuperación adicional, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo recubierto de BSA 15 mL. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para dispersar la capa grasa. Centrifugar a 450 x g durante 10 min al RT. aspirar el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad de medios en el tubo para evitar aspirar el pellet de la célula.
  11. Aspiran la capa acuosa desde el tubo con el pellet original.
  12. Añadir 10 mL de DMEM/F12 al tubo con el pellet original y transferirlo al segundo tubo. Pipetear vigorosamente para combinar y resuspender los dos gránulos.
  13. Centrifugar a 450 x g durante 10 min al RT. aspirar el sobrenadante y añadir 4 ml de DMEM/F12 al tubo.
  14. Añadir 40 μL de desoxiribonuclease (DNase) a la suspensión y agitar suavemente con la mano durante 2-5 min en RT. la solución de DNase consta de 4 DNase de U/mL en DMEM/F12.
  15. Añadir 6 mL de DMEM/F12 y pipetear a fondo. Centrifugar el tubo a 450 x g durante 10 min en RT.
  16. Aspirar sobrenadante a la marca de 0,5 mL. Resuspend en 10 mL de DMEM/F12 y pipetear a fondo.
  17. Pulse para 450 x g y parada 4 s después de alcanzar esa velocidad.
  18. Repita los pasos 1.16-1.17 tres veces más para purificar los organoides mediante la diferenciación centrífuga. El pellet debe ser ahora un color blanquecino consistente en organoides epiteliales (figura 1H).
    Nota: los organoides también se pueden filtrar mediante filtros de malla estéril de 40 μm. Después del paso 1,16, los medios de pipetas que contienen organoides a través de un filtro en un tubo centrífugo, y luego enjuagar con 5 a 10 mL de medios DMEM/F12. Voltear el filtro sobre un nuevo tubo de centrifugación de 50 mL. Pase 10 mL de medios DMEM/F12 a través, yendo de la manera opuesta para enjuagar cualquier retentate. El concentrado debe consistir en organoides, y el filtrado debe consistir principalmente de células estrales, que pueden ser desechadas o mantenidas si se desea.

2. determinación de la densidad y los organoides de chapado

  1. Resuspend pellet en 10 mL de DMEM/F12. Pipetear a fondo para crear una solución homogénea.
  2. Transferir 50 μL a una placa de Petri de 30 mm, y ver bajo un microscopio de contraste de fase a 20x. Cuente el número de organoides con un contador de conteo.
    Nota: aquí las puntas de las pipetas se han utilizado consistentemente con un diámetro mínimo de 457 μm, que es 5-10 veces el diámetro de los organoides que se sembraron. Para transferir volúmenes de 2 mL o más (p. ej., los pasos 1,16 y 2,1), utilice pipetas serológicas con diámetros de punta superiores a 1.500 μm.
  3. Calcule la densidad organoide utilizando la siguiente ecuación:
    Equation
    La densidad deseada es de 1.000 organoids/mL para simplificar la dilución adicional. Si la densidad es demasiado baja, Centrifugue a 450 x g durante 5 min y Aspire medios. Añadir medios necesarios para llegar a 1.000 organoids/mL, y pipetear a fondo para crear una mezcla homogénea.
    1. Para cultivar organoides en una matriz proteica, los organoides de semilla a una concentración de 1 organoid/L en colágeno tipo 1 se diluyeron al 87% o en la membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm. Mientras trabaje con muestras, Manténgase en hielo.
    2. Para congelar los organoides, transfiera el volumen deseado a un tubo de centrifugación separado. Gire hacia abajo a 450 x g durante 5 min. Aspirate medios, y luego agregue el mismo volumen de 90% FBS/10% DMSO. Resuspend los organoides y luego alícuota en crisotubos. Transferir a-80 ° c, y luego a nitrógeno líquido dentro de una semana.
    3. Para descongelar, calentar en un baño de agua de 37 ° c durante un minuto. Centrifugar a 450 x g durante 5 min, y luego aspirar los medios de congelación. Enjuagar con DPBS estéril, y luego centrifugar de nuevo. Aspiran DPBS y añaden medios organoides.
  4. Pipetear 50 μL (50 organoides) en cada pozo de la placa de baja adherencia (figura 1I).
  5. Añadir 150 μL de medio organoide para que el volumen de trabajo total sea de 200 μL. los medios organoides consisten en 1% de penicilina-estreptomicina y 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS) en medios DMEM/F12.
  6. Cada 2 días Reemplace los medios cuidadosamente.
    Nota: las placas de baja adherencia no son tratadas con cultivo de tejidos; por lo tanto, las células se pueden desprenderse fácilmente. Aspiran los medios lentamente inclinando la placa e insertando la punta de la Piera en el borde de cada pozo. Deje una pequeña cantidad de medios en la parte inferior del pozo. Agregue nuevos medios lentamente para evitar la aplicación de fuerzas de cizallamiento innecesarias a los organoides.

3. coculturación con macrófagos

  1. Mantener los macrófagos crudos etiquetados con GFP o dTomato 264,7 en medios DMEM complementados con 10% de FBS y 1% de penicilina-streptomicina. Semilla 1 x 104, 5 x 104, o 1 x 105 células/ml en medio organoide.
  2. Utilice el contraste de fase de células vivas y la imagen fluorescente para monitorear la infiltración de macrófagos con el tiempo.

4. tinción de inmunofluorescencia de organoides

Nota: los organoides se pueden teñir en pozos de baja adherencia o pueden transferirse a portaobjetos de cámara. Para transferir, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que los organoides se hayan desprendido de las placas. Transferir a los portaobjetos de cámara e incubar durante 4-8 h para permitir que los organoides se adhieran a la superficie de la placa.

  1. Retire el medio organoide de los pozos aspirando cuidadosamente. Fije las muestras con un 10% de formalina amortiguada neutral durante 15 min en RT.
  2. Lavar 3x 5 min en 1x PBS. Si se desea, las muestras fijas se pueden almacenar a 4 ° c durante una semana para su posterior tinción.
  3. Permeabilizar con 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetrametilbutilo) fenil-polietilenglicol durante 5 min.
    Nota: para manchar para F-actin, incubar muestras con Phalloidin diluido 1:1000 y 1,67 nM bisbenzimida tinte nuclear en 1% PBS/BSA para 1 h en RT. A continuación, proceda al paso 4,8.
  4. Bermeabilize con 0,5 PBS. Las muestras pueden almacenarse en imágenes 4opy e imágenes inmunofluorescentes. mecanismos que contribuyen al RLOCK CTC con 5% suero de cabra normal en 0,1% PBS/polietilenglicol sorbitán monolaurato (pbst) para 1 h en RT. lavar 3x 5 min con PBS.
  5. Incubar con anti-citoqueratina 14 diluido 1:1000, E-cadherin diluido 1:200, o proteína de Unión apretada uno diluido 1:100 en 1% NGS en PBST para 1 h en RT. lavar 3x 5 min en PBST.
  6. Incubar con cabra anti-conejo secundario diluido 1:200 con 1% NGS/PBST para 1 h en RT. Cubra con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
  7. Lavar 3x 5 min en PBS. Utilice el tinte nuclear (ver tabla de materiales) para manchar los núcleos.
  8. Lavar 3x 5 min en PBS. Si utiliza un portaobjetos de cámara, Monte con un resguardo. Almacenar envuelto en papel de aluminio a 4 ° c durante un máximo de 2 semanas.

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Representative Results

Los organoides epiteliales irradiados se obtuvieron con éxito a partir de glándulas mamarias de ratones, procesadas y cultivadas en placas de baja adherencia (figura 1). El rendimiento organoide se probó por siembra en diferentes ambientes de crecimiento (figura 2A-G). Las células de siembra directamente en el cultivo de tejidos tratados con placas de células de 10 cm produjeron un crecimiento excesivo de células de fibroblastos. Los fibroblastos fueron identificados bajo la microscopía de contraste de fase en o cerca del mismo plano de enfoque como organoides, y rápidamente crecieron a partir de organoides chapados en pocos días. También se observó una proliferación de fibroblastos cuando los organoides se sembraron en matrices de proteínas de colágeno y membranas del sótano (Figura 2E, F).

Se probaron diversas condiciones para optimizar el crecimiento organoide irradiado (figura 2H). Los tipos de collagenasa I y VIII de Clostridium Histolyticum se utilizaron como enzima en la etapa de digestión organoide12,16,17. Los rendimientos organoides fueron significativamente mayores después de la digestión con la colagenasa VIII. Esto puede deberse a los procesos de purificación utilizados en la producción de la enzima: el tipo de collagenasa I está parcialmente purificado y puede causar daños innecesarios a las proteínas y receptores de la membrana, lo que lleva a una mala formación organoide, lisis celular o sobre-digestión16 , 17 , 18. no se observaron diferencias significativas en el rendimiento entre los organoides irradiados y de control.

Los organoides irradiados podrían cultivarse en placas de baja adherencia (figura 3a-C) o dentro de la membrana del sótano (figura 3D-G), pero el crecimiento más rápido se produjo en placas de baja adherencia (figura 3H). Los organoides han recapitulado las características de las glándulas mamarias. Las puntas de flecha blancas indican construcciones morfológicamente similares a los conductos y lóbulos19, 20,21 (Figura 3C), que son fundamentales para la producción y el transporte de leche en la glándula mamaria21. Sin embargo, se requiere una mayor caracterización para confirmar esta observación. Las tendencias de crecimiento indicaron que los organoides no irradiados crecieron más rápido que los organoides irradiados (figura 3H), probablemente debido a la detención de crecimiento celular resultante de mecanismos de reparación de daños en el ADN; sin embargo, la tendencia no fue estadísticamente significativa22. Se observó una aglomeración ocasional de organoides de baja adherencia, y los organoides podrían cultivarse hasta dos semanas antes de disociar.

Los organoides expresaron características epiteliales, que fueron evaluados a través de la tinción de inmunofluorescencia de citoqueratina 14 (K14), e-cadherin (e-CAD), y la proteína de Unión apretada 1 (ZO-1)23,24,25 ( Figura 4). Los organoides irradiados expresaron marcadores epiteliales. K14, un marcador del mioepitelio23, se expresó fuertemente en la superficie de los organoides irradiados (figura 4a). Adicionalmente, E-CAD y ZO-1 fueron expresados dentro de uniones celulares de organoides (Figura 4B, C). Estas proteínas son esenciales para la adherencia adecuada de la célula24. Después de la irradiación, los organoides continuaron conservando sus características epiteliales.

La tinción fluorescente de los organoides podría visualizarse en placas de baja adherencia utilizando microscopía de fluorescencia (figura 5A-D); sin embargo, la visualización más clara se obtuvo a través de la microscopía confocal (figura 5E-F). La intensidad total corregida de la fluorescencia se calculó restando el fondo y normalizando por el área organoide (figura 5g). Los organoides crecientes en las placas de baja adherencia 96-Well también simplificaron los experimentos de co-cultivo. Cuando se siembra en concentraciones típicas en la glándula mamaria, los macrófagos colocalizados con el control y los organoides irradiados (figura 6)24,26.

Figure 1
Figura 1. Método Workflow. (A) las glándulas mamarias fueron reeliminadas de los ratones. Se utilizaron las glándulas mamarias abdominales e inguinales. (B) las glándulas mamarias fueron irradiadas en 50 ml de tubos centrífugas que contenían medios DMEM/F12. (C) las glándulas mamarias fueron transferidas a placas estériles de seis pozo y cortadas con escalpelos quirúrgicos hasta que se picaron (D). (E) las glándulas mamarias fueron transferidas a 50 ml de tubos centrífugas que contenían 5 ml de medios de DMEM/F12 estériles por glándula y se digirieron en una solución de colagenasa VIII (F). (G) después de ser transferido a un tubo de 15 ml, se utilizó la diferenciación centrífuga para eliminar las células estrales, células individuales y glóbulos rojos, observados en un pellet rojo (flecha blanca) hasta que sólo se obtuvieron organoides epiteliales blancos (H ). (I). 50 los organoides fueron chapados en 200 μL de soportes en placas de baja adherencia de 96-pozo y se han fotografiado utilizando la microscopía de contraste de fase la barra de escala representa 50 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Recubrimiento organoide en matrices de proteínas 3D y en tejido de plástico tratado con cultivo de tejidos. Organoides sembrados en colágeno (A) y membrana basal (B), imágenes después de 84 horas de crecimiento. La proliferación de fibroblastos se produjo en organoides chapados en matriz (C, D). Las imágenes de contraste de fase de los organoides ordenados mediante filtración se obtuvieron 192 horas después de la siembra. No se observaron diferencias importantes entre el filtrado (E) y el concentrado (F), y ambos resultaron en un crecimiento de fibroblastos confluentes. Las células en e y F fueron sembradas en el cultivo de tejido plástico tratado. Después de tripsinizing durante 5 min en RT, los fibroblastos fueron removidos por aspiración; sin embargo, las células epiteliales restantes formaron una cultura monocapa en lugar de los organoides tridimensionales (G). Las barras de escala para A-G representan 100 μm. (H) se probaron diferentes tipos de colagenasas (I (CI) y VIII (CVIII)) y métodos de procesamiento celular (filtración y diferenciación centrífuga (cent diff)), y el rendimiento organoide por glándula mamaria fue cuantificado (n = 2 glándulas para CI, filtro; 2 glándulas para CVIII, filtro; 4 glándulas para CI, cent diff y 12 glándulas para CVIII, cent diff). La significancia estadística se determinó utilizando una prueba t de dos colas y no emparejadas, * * * p < 0.0001. Las barras de error representan un error estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Crecimiento organoide representativo. Contraste de fase imágenes de crecimiento organoide irradiado en placas de baja adherencia obtenidas 20 (A), 44 (B), y 106 (C) horas después de la siembra. Las puntas de flecha blancas indican estructuras que tienen una morfología similar a los conductos y lóbulos. Las imágenes de contraste de fase del crecimiento organoide irradiado en la membrana basal obtuvieron 42 (D), 66 (E), 60 (F) y 114 (G) horas después de la siembra. Las barras de escala representan 50 μm. H. Las mediciones de área se obtuvieron en diferentes condiciones de crecimiento: organoides inmediatamente sembrados después de la digestión y la clasificación (irradiado (●), control (▪)), y organoides sembrados en la membrana del sótano (irradiado (○), control (□)) (n = 3 glándulas cada uno). Los cálculos de área se realizaron utilizando el software ImageJ. Las barras de error representan un error estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Expresión de marcador epitelial en organoides irradiados. La citoqueratina 14 (K14, verde), un marcador para la capa basal de epithelia escamosa y no escamosa, se expresó en los organoides irradiados (a). E-cadherin (E-CAD), una proteína esencial para la adherencia, se expresó dentro de las uniones entre las células en los organoides irradiados (B). La proteína de Unión estrecha uno (ZO-1) también se expresó dentro de los cruces celulares de los organoides irradiados (C). Las imágenes se obtuvieron en los portaobjetos mediante microscopía confocal. Se usó una mancha de ácido nucleico para visualizar los núcleos (azul). Todos los organoides fueron fijados e imágenes después de una semana de crecimiento. Las barras de escala son de 50 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Expresión F-actin en organoides. El F-actin (rojo), un microfilamento en células epiteliales, se expresó con menor intensidad en los organoides no irradiados (a, C, E) que en los organoides irradiados (B, D, F). Se usó una mancha de ácido nucleico para visualizar los núcleos (azul). Las imágenes fueron tomadas en placas de 96-pozo de baja adherencia (A, B) y portaobjetos de cámara de 16 pozo (C, D). También se tomaron imágenes utilizando la microscopía confocal (E, F). Todos los organoides fueron fijados e imágenes después de una semana de crecimiento. Las barras de escala son 50 μm. G. Los datos de fluorescencia de Phalloidin de imágenes de placa de baja adherencia se cuantificaron en ImageJ (n = 3 glándulas). Las barras de error indican un error estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Evaluar las interacciones de células celulares a través de la co-cultura de macrófagos-organoides. Macrofagos (rojo) control infiltrado (A) y organoides irradiados (B). Las barras de escala representan 50 μm. El área porcentual media de los macrófagos en el campo de la imagen (C) se notificó a las 24 horas de co-cultivo para el control (amarillo) y los organoides irradiados (naranja) (n = 3 glándulas para cada muestra). Los macrófagos fueron sembrados en concentraciones de 10.000 células/mL, 50.000 células/mL, y 100.000 células/mL, y su infiltración fue capturada cada 30 minutos a través de imágenes de fluorescencia de células vivas. Todos los experimentos de co-cultivo comenzaron 7 días después de la siembra organoide inicial. La significancia estadística se determinó utilizando una prueba t de dos colas y no emparejadas, * p < 0.05, * * * p < 0.0001. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este protocolo, hemos desarrollado un método para el crecimiento reproducible y la caracterización de los organoides mamarios irradiados (figura 1). Se aplicó una dosis de irradiación de 20 GY para reflejar los modelos anteriores in vivo de reclutamiento de células tumorales5. La irradiación de las glándulas mamarias ex vivo antes de la formación organoide permitió el aislamiento de los efectos de daño por radiación sin una infiltración correspondiente de las células inmunitarias. El desarrollo de un modelo de tejido normal irradiado in vitro permite ver en tiempo real las interacciones celulares que pueden contribuir al reclutamiento de CTC inducido por radiación11,12.

Los pasos siguientes 1.5-1.18 fueron críticos para maximizar el rendimiento organoide. Añadimos alícuas descongeladas de la colagenasa concentrada a la solución digestiva. Debido a la naturaleza altamente viscosa de la alícuota concentrada de la colagenasa, puede haber algunas variaciones en la cantidad y por lo tanto en la actividad enzimática, por lo que la digestión organoide debe ser estrechamente monitoreada para evitar la sobredigestión. También es importante digerir los organoides en un tubo de 50 mL, ya que esto permite un área de superficie incluso para la digestión. Otros estudios han utilizado la filtración para purificar organoides19,23; sin embargo, obtuvimos un rendimiento mucho más alto purificante con diferenciación centrífuga (figura 2H). Las pipetas de recubrimiento anticipado, las puntas de piletas y los tubos de centrifugación con la solución de BSA son esenciales para maximizar el rendimiento. Los organoides se adhieren notablemente al plástico sin recubrimiento cuando se descuida la aplicación de la solución.

Se debe tener mucho cuidado para evitar la aspiración de organoides. Este es un riesgo que se produce cuando se purifican, cambian los medios y se mancha para los marcadores fluorescentes. El uso de placas de baja adherencia para el crecimiento permite una fácil transferencia de organoides y elimina la necesidad de que los organoides se seccionen en OCT para su posterior tinción, un procedimiento necesario para los organoides incrustados de membrana sótano11. Además de los beneficios de un crecimiento superior, la siembra de organoides irradiados en placas de baja adherencia requirió menos pasos y fue menos difícil técnicamente que el cultivo de organoides en membrana basal o colágeno. Sin embargo, al teñir los marcadores, puede ser útil ver los organoides bajo un microscopio para garantizar que no se produzca una aspiración accidental.

Por otra parte, hay muchas consideraciones que deben tenerse en consideración cuando los organoides de imagen. Dentro de los organoides incrustados de la membrana del sótano, se puede observar un crecimiento ocasional de fibroblastos (figura 2C, D). El crecimiento de fibroblastos en los organoides cultivados en 3D puede deberse a que los organoides hacen contacto con la superficie tratada con el cultivo del tejido, ya que la adherencia conduce a la producción del factor de crecimiento de fibroblastos en las células adherentes27. Curiosamente, la morfología de estos fibroblastos es sorprendentemente similar a los pre-adipocitos ya que ambos tipos de células exhiben hule, formas alargadas28. En investigaciones adicionales, la exposición a insulina, dexametasona y 3-isobutilo-1-metilxantina (IBMX) puede producir células con un linaje adipogénico, estimulando un cambio hacia una forma celular más esférica asociada con los adipocitos28, 29. hemos obtenido imágenes claras utilizando la microscopía de contraste de fase de baja adherencia de crecimiento libre (figura 3a-C) y los organoides de membrana sótano incrustados (figura 3D-G). Sin embargo, el seguimiento del crecimiento organoide individual en placas de baja adherencia fue difícil debido a las mínimas adherencias focales entre las células y la superficie del pozo, resultando en un movimiento organoide y una aspiración ocasional.

Una vez manchadas para marcadores de superficie, la microscopía confocal hizo una localización de marcadores más clara (figura 5e, F) que la microscopía WIDEFIELD (figura 5A-D). A partir de la cuantificación de la fluorescencia, las tendencias en la expresión de Phalloidin sugieren que los organoides irradiados expresaron una mayor relación de la F-actin con el control (figura 5g). La reorganización del citoesqueleto de actin se ha observado en células endoteliales microvasculares dérmicas irradiadas a dosis similares30.

Para las secuencias de imágenes extendidas, como la cocultura de lapso de tiempo con células inmunitarias (figura 6), se requiere una cámara de imágenes de células vivas con humedad y control de co2 31. Las imágenes de células vivas tomadas cada 30 minutos revelaron que los macrófagos colocalizados con organoides después de 24 horas (figura 6A, B), migrando preferentemente hacia los organoides irradiados (Figura 6C). La infiltración de macrófagos en tejido normal irradiado se ha observado in vivo, se atribuye a los gradientes de chemokine y citoquina, y normalmente precede al reclutamiento de CTC5. Los estudios futuros evaluarán las interacciones de macrófagos clásicas y alternativamente activadas con organoides, ya que las dinámicas de macrófagos polarizadas pueden desempeñar un papel importante en la determinación de la respuesta a la radiación32,33. Los análisis adicionales evaluarán la consecuencia de la inanición del suero y los efectos de crecimiento de los organoides cultivantes en los medios completos, ya que estas variables pueden tener efectos significativos en las interacciones de las células organoides-inmunes. Este sistema puede ser adaptado aún más para la co-cultura con otros tipos de células, incluyendo CD8 + células T, células del estroma, adipocitos, y células de cáncer de mama. La observación en tiempo real con técnicas como las imágenes de células vivas facilitará la elucidación de los mecanismos potenciales que contribuyen al reclutamiento de CTC para el tejido normal irradiado, que puede tener implicaciones significativas para los pacientes que sufren de recurrentes TNBC.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a la Dra. Laura L. Bronsart por proveer los macrófagos RAW 264,7 etiquetados con GFP y dTomato. Esta investigación fue apoyada financieramente por la beca NIH #R00CA201304.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

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References

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Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias
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