Organoids ontwikkeld van muis borstklieren werden bestraald en gekarakteriseerd om epitheel eigenschappen en interacties met immuun cellen te beoordelen. Bestraalde organoids kan worden gebruikt om cel-cel interacties beter te evalueren die tot de rekrutering van de tumor cel in bestraald normaal weefsel kunnen leiden.
Organoids afgeleid van het verteerd weefsel zijn multicellulaire driedimensionale (3D) constructies die beter recapituleren in vivo omstandigheden dan cel monolayers. Hoewel ze niet volledig kunnen modelleren in vivo complexiteit, behouden ze een aantal functionaliteit van het oorspronkelijke orgel. In kanker modellen, organoids worden vaak gebruikt om tumor cel invasie studie. Dit protocol beoogt te ontwikkelen en te karakteriseren organoids van de normale en bestraalde muis borstklier weefsel om de straling reactie in normale weefsels te evalueren. Deze organoids kunnen op toekomstige in vitro kanker studies worden toegepast om de interactie van de tumor cel met bestraalde organoids te evalueren. De borstklieren werden ontleed, bestraald tot 20 GY en verteerd in een Collagenase VIII oplossing. De epitheel organoids werden gescheiden via centrifugaal differentiatie, en 3D organoids werden ontwikkeld in 96-goed laag-adhesie microplaten. Organoids drukte de kenmerkende epitheel teller cytokeratine 14 uit. Macrofagen interactie met de organoids werd waargenomen in co-cultuur experimenten. Dit model kan nuttig zijn voor het bestuderen van tumor-stromale interacties, infiltratie van immune cellen, en de polarisatie van de macrofagen binnen een bestraald micro-milieu.
Ongeveer 60% van de drievoudige negatieve borstkanker (TNBC) patiënten kiezen voor borst-conserverende therapie (BCT) als een vorm van behandeling1. In deze behandeling modaliteit, de tumor die een deel van het borstweefsel wordt verwijderd, en de omliggende normale weefsel wordt blootgesteld aan ioniserende straling om eventuele resterende tumorcellen te doden. De behandeling vermindert herhaling in veel van de bevolking van borstkanker; echter, ongeveer 13,5% van de behandelde patiënten met TNBC ervaring locoregionale herhalingen2. Daarom, het bestuderen van hoe straling kan aanwerven circulerende tumorcellen (ctcs) zal leiden tot belangrijke inzichten in de lokale recidief3,4.
Het vorige werk heeft aangetoond dat de straling van het normale weefsel rekrutering van diverse cel types5verhoogt. In pre-klinische modellen van TNBC, bestraling van normaal weefsel toegenomen macrofagen en vervolgens tumor cel rekrutering tot normale weefsels5. De immune status beïnvloedde de rekrutering van de tumor cel aan bestraalde plaatsen, met de migratie van de tumor cel waargenomen in immuungecompromitteerde onderwerpen. Recapitulerend deze interacties met behulp van organoids afgeleid van de borstklieren zal de observatie van de cel migratie en cel-stromale interacties in real-time met microscopie en live cel beeldvorming om de rol van straling schade te bepalen in het veranderen tumor cel gedrag.
Muis borstklieren organoids hebben geholpen bij het ophelderen van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de borstklier. Een borst organite is een multicellulaire, driedimensionale constructie van geïsoleerde borst epitheel dat groter is dan 50 μm6,7,8,9,10. Met behulp van primaire epitheel organoids, Simian et al. geëvalueerd noodzakelijke factoren voor vertakking in de borstklier7. Shamir et al. ontdekte dat de verspreiding kan plaatsvinden zonder een epitheel om mesenchymale overgang, het verstrekken van inzicht in de gemetastaseerde Cascade8. Methoden voor het genereren en karakteriseren organoids van de borstklier weefsel zijn goed ingeburgerd6,11,12,13. Nochtans, aan onze kennis, zijn de methodes om bestraalde organoids van borstklieren te kweken niet gemeld. Een protocol voor het kweken van en het kenmerken van bestraalde organoids zou een kritieke stap in Recapitulerend straling-veroorzaakte immune en de rekrutering van de tumor cel zijn.
In deze paper, rapporteren we een methode voor het kweken en karakteriseren bestraalde borstklier epitheel organoids in lage adhesie microplates bekleed met een hydrofiele polymeer dat de vorming van sferoïden ondersteunt. Deze organoids werden samen met macrofagen gekweekt om de kinetiek van infiltratie van de immune cel te onderzoeken. Dit werk kan worden uitgebreid tot co-kweken organoids met vetcellen te recapituleren borstklieren kenmerken, borstkanker cellen te visualiseren tumor cel aanwerving, en CD8 + T cellen te bestuderen tumor-immune cel interacties. Eerder vastgestelde protocollen kunnen worden gebruikt om bestraalde organoids te evalueren. Eerdere modellen co-kweken borstklieren organoids en immuun cellen hebben licht werpen op de mechanismen van metastase en verspreiding. Denardo et al. vond dat CD4 + T Cell regulering van tumorgeassocieerde macrofagen verbeterde een gemetastaseerde fenotype van de borst adenocarcinomen14. Er zijn ook cocultuur modellen gebruikt om mechanismen van biologische ontwikkeling te verhelderen. Plaks et al. verduidelijkte de rol van CD4 + T cellen als down-regulatoren van de borst organogenese15. Echter, onze groep is de eerste om een procedure van het visualiseren van hoe normaal weefsel straling invloeden immuun cel gedrag vast te stellen. Omdat normaal weefsel bestraling is aangetoond dat tumor cel rekrutering te verbeteren5, kan dit Protocol verder worden ontwikkeld om te analyseren hoe tumorcellen gedrag wordt gewijzigd door bestraling van normale weefsels en cellen, wat leidt tot een beter begrip van kanker recidief.
In dit protocol hebben we een methode ontwikkeld voor reproduceerbare groei en karakterisering van bestraalde borst organoids (Figuur 1). Een stralingsdosis van 20 GY werd toegepast op de spiegel vorige in vivo modellen van de cel van de tumor rekrutering5. Bestraling van de borstklieren ex vivo voorafgaand aan organite vorming toegestaan voor isolatie van stralingsschade effecten zonder een overeenkomstige infiltratie van het immuunsysteem cellen. De ontwikkeling van…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Dr. Laura L. Bronsart voor het verstrekken van GFP en dTomato-gelabelde RAUWe 264,7 macrofagen. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
Collagen Type I | Corning | 354236 | |
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
DNAse | Roche | 10104159001 | |
DPBS | Fisher | 14190250 | |
E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
FBS | Sigma | F0926 | |
Gentamicin | Gibco | 15750 | |
Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
PBS | VWR | 10128-856 | |
Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |