Vækst og karakterisering af bestrålede Organoider fra mælkekirtler
Summary
Organoider udviklet fra muse brystkirtler blev bestrålet og karakteriseret til at vurdere epiteliale træk og interaktioner med immunceller. Bestrålede organoider kan bruges til bedre at evaluere celle celle interaktioner, der kan føre til tumor celle rekruttering i bestrålet normalt væv.
Abstract
Organoider afledt af det fordøjet væv er fler cellulære tredimensionale (3D) konstruktioner, der bedre rekapitulere in vivo betingelser end celle monolayers. Selv om de ikke helt kan model in vivo kompleksitet, de bevarer nogle funktionalitet af det oprindelige organ. I kræft modeller, organoider er almindeligt anvendt til at studere tumor celle invasion. Denne protokol har til formål at udvikle og karakterisere organoider fra den normale og bestrålede muse brystkirtler væv til at evaluere stråling respons i normale væv. Disse organoider kan anvendes til fremtidige in vitro Cancer undersøgelser for at evaluere tumor celle interaktioner med bestrålede organoider. Mælkekirtler blev påvirket, bestrålet med 20 Gy og fordøjet i en kollagenase VIII-opløsning. Epitelial organoider blev adskilt via centrifugal differentiering, og 3D organoider blev udviklet i 96-godt lav-vedhæftning mikroplader. Organoider udtrykte den karakteristiske epitelial markør cytokeratin 14. Makrofag interaktion med organoider blev observeret i co-kultur eksperimenter. Denne model kan være nyttig til at studere tumor-stromale interaktioner, infiltration af immunceller, og makrofag polarisering inden for et bestrålet mikromiljø.
Introduction
Ca. 60% af de tredobbelte negative brystkræftpatienter (TNBC) vælger amnings behandling (BCT) som en form for behandling1. I denne behandling modalitet fjernes tumoren, der indeholder en del af brystvæv, og det omgivende normale væv udsættes for ioniserende stråling for at dræbe eventuelle resterende tumorceller. Behandling reducerer recidiv i en stor del af brystkræft populationen; Men, ca. 13,5% af behandlede patienter med TNBC erfaring lokoregional gentagelser2. Derfor, studere hvordan stråling kan rekruttere cirkulerende tumorceller (ctc’er) vil føre til vigtig indsigt i lokal gentagelse3,4.
Tidligere arbejde har vist, at stråling af det normale væv øger rekrutteringen af forskellige celletyper5. I prækliniske modeller af TNBC, bestråling af normale væv øget makrofag og efterfølgende tumor celle rekruttering til normale væv5. Immunstatus påvirkede tumor celle rekruttering til bestrålede steder, med tumor celle migration observeret hos immunkompromitterede forsøgspersoner. Rekapitulating disse interaktioner ved hjælp af organoider afledt af brystkirtler vil gøre det muligt observation af celle migration og celle-stromale interaktioner i realtid med mikroskopi og levende celle Imaging til at bestemme den rolle, stråling skader i at ændre tumor celle adfærd.
Muse bryst organoider har hjulpet med at belyse vigtige trin i udviklingen af brystkirtlen. En bryst organoid er en flercellet, tredimensionel konstruktion af isoleret bryst Epitelet, der er større end 50 μm6,7,8,9,10. Ved brug af primære epitelial organoider evaluerede Simian et al. de nødvendige faktorer for forgreningen i brystkirtlen7. Shamir et al. opdagede, at spredning kan ske uden en epitel til mesenkymale overgang, giver indsigt i den metastatiske kaskade8. Metoder til generering og karakterisering af organoider fra mælke kirtlens væv er veletablerede6,11,12,13. Men til vores viden, metoder til dyrkning af bestrålede organoider fra brystkirtler er ikke blevet rapporteret. En protokol til dyrkning og karakterisering af bestrålede organoider ville være et kritisk skridt i at rekapitulere stråling-induceret immun og tumor celle rekruttering.
I dette dokument rapporterer vi om en metode til dyrkning og karakterisering af bestrålede bryst epitelial organoider i lave vedhæftnings mikroplader belagt med en hydrofile polymer, der understøtter dannelsen af sfæroider. Disse organoider blev co-kuleret med makrofager at undersøge immuncelle infiltration kinetik. Dette arbejde kan udvides til at omfatte Co-culturing organoider med fedtvæv celler til at rekapitulere bryst egenskaber, brystkræft celler til at visualisere tumor celle rekruttering, og CD8 + T celler til at studere tumor-immuncelle interaktioner. Tidligere etablerede protokoller kan anvendes til vurdering af bestrålede organoider. Tidligere modeller, der co-kulerer mælke-organoider og immunceller har kaste lys over mekanismer af metastaser og formidling. Denardo et al. fandt, at CD4 + T-celle reguleringen af tumor associerede makrofager forstærkede en metastatisk fænotype af bryst adenocarcinomer14. Samkulturmodeller er også blevet brugt til at belyse mekanismerne for biologisk udvikling. Plaks et al. præciserede betydningen af CD4 + T-celler som ned-regulatorer af bryst organogenesen15. Men vores gruppe er den første til at etablere en procedure for at visualisere, hvordan normal vævs bestråling påvirker immuncelle adfærd. Fordi normal vævs bestråling har vist sig at forbedre tumor celle rekruttering5, denne protokol kan videreudvikles til at analysere, hvordan tumor celle adfærd er ændret ved bestråling af normale væv og celler, hvilket fører til en større forståelse af kræft.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol har vi udviklet en metode til reproducerbar vækst og karakterisering af bestrålede mælke organoider (figur 1). En bestrålingsdosis på 20 Gy blev anvendt til at spejle tidligere in vivo-modeller af tumor celle rekruttering5. Bestråling af brystkirtler ex vivo før organoid dannelse tilladt for isolering af stråling skader virkninger uden en tilsvarende infiltration af immunceller. Udviklingen af en in vitro-bestrålet normal vævs model muliggø…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Laura L. Bronsart for at levere GFP og dTomato-mærkede RAW 264,7 makrofager. Denne forskning blev støttet finansielt af NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, 4229-4238 (2010).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
