Zebravis embryo’s worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo’s bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.
De zebravis is een algemeen gebruikte modelorganisme voor de ziekte en fenotype-based drug Discovery. De zebravis genereert veel nakomelingen, heeft transparante embryo’s en een snelle externe ontwikkeling. Zebravis embryo’s kunnen daarom ook worden gebruikt voor de snelle evaluatie van de toxiciteit van de geneesmiddelen die kostbaar zijn en in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. In dit artikel wordt een methode beschreven voor het efficiënt screenen van de toxiciteit van chemische verbindingen met 1-5-Day Post fertilisatie embryo’s. De embryo’s worden gecontroleerd door stereomicroscoop om de fenotypische defecten te onderzoeken die worden veroorzaakt door de blootstelling aan verschillende concentraties van verbindingen. Half-maximale dodelijke concentraties (LC50) van de verbindingen worden ook bepaald. De huidige studie vereiste 3-6 mg van een verbinding van de remmer, en het hele experiment duurt ongeveer 8-10 h worden voltooid door een individu in een laboratorium met basisvoorzieningen. Het huidige protocol is geschikt voor het testen van een verbinding om onverdraaglijke toxische of off-target effecten van de compound in de vroege fase van de opsporing van geneesmiddelen te identificeren en om subtiele toxische effecten te detecteren die kunnen worden gemist in de celkweek of andere diermodellen. De methode vermindert de procedurele vertragingen en de kosten van de ontwikkeling van geneesmiddelen.
De ontwikkeling van geneesmiddelen is een kostbaar proces. Voordat een enkele chemische verbinding wordt goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) enkele duizend verbindingen worden gescreend tegen een kostprijs van meer dan 1.000.000.000 dollar1. Tijdens de preklinische ontwikkeling is het grootste deel van deze kosten vereist voor de dierproeven2. Om de kosten te beperken, hebben onderzoekers op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling alternatieve modellen nodig voor de veiligheids screening van chemische verbindingen3. Daarom, in de vroege fase van de ontwikkeling van het geneesmiddel, het zou zeer gunstig zijn voor het gebruik van een methode die snel de veiligheid en de toxiciteit van de verbindingen in een geschikt model kan evalueren. Er zijn verschillende protocollen die zijn gebruikt voor de toxiciteits screening van chemische verbindingen waarbij dier-en celkweek modellen zijn betrokken, maar er is geen enkel protocol dat wordt gevalideerd en dat gemeenschappelijk wordt gebruikt4,5. Bestaande protocollen die zebravis gebruiken, variëren in lengte en zijn gebruikt door individuele onderzoekers die de toxiciteit hebben geëvalueerd aan de hand van hun gemak vereiste6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
In het recente verleden is de zebravis naar voren gekomen als een handig model voor de evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen tijdens de embryonale ontwikkeling op6,7. De zebravis heeft veel ingebouwde voordelen voor de evaluatie van chemische verbindingen13. Zelfs grootschalige experimenten zijn vatbaar, omdat een zebravis-vrouw batches van 200-300 eieren kan leggen, die snel ex vivoontwikkelen, geen externe voeding nodig hebben voor maximaal een week en transparant zijn. De verbindingen kunnen direct in het water worden toegevoegd, waar ze kunnen (afhankelijk van de aard van de compound) diffuus door de chorion, en na het uitkomen, door de huid, kieuwen en de mond van larven. De experimenten vereisen geen overvloedige hoeveelheden chemische verbindingen14 vanwege de geringe omvang van het embryo. Het ontwikkelen van zebravis embryo’s Express de meeste eiwitten die nodig zijn om het normale ontwikkelings resultaat te bereiken. Daarom is een zebravis embryo een gevoelig model om te beoordelen of een potentieel medicijn de functie van een eiwit of signalerings molecuul dat ontwikkelend significant is, kan verstoren. De organen van de zebravis worden functioneel tussen 2-5 DPF15, en verbindingen die giftig zijn tijdens deze gevoelige periode van embryonale ontwikkeling induceren fenotypische defecten in zebravis larven. Deze fenotypische veranderingen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met behulp van een eenvoudige Microscoop zonder invasieve technieken11. Zebravis embryo’s worden veel gebruikt in toxicologisch onderzoek vanwege hun veel grotere biologische complexiteit in vergelijking met in vitro geneesmiddelen screening met behulp van celkweek modellen16,17. Als gewervelde is de genetische en fysiologische make-up van zebravis vergelijkbaar met de mens en daarom zijn de toxiciteiten van chemische verbindingen vergelijkbaar tussen zebravis en mensen8,18,19, 20 , 21 , 22. zebravis is dus een waardevol hulpmiddel in de vroege fase van de geneesmiddelen ontdekking voor de beoordeling van de toxiciteit en de veiligheid van de chemische verbindingen.
In dit artikel geven we een gedetailleerde beschrijving van de methode die wordt gebruikt voor het evalueren van de veiligheid en de toxiciteit van koolzuuranhydrase (CA) remmer-verbindingen met behulp van 1-5-Day Post fertilisatie (DPF) zebravis-embryo’s door een enkele onderzoeker. Het protocol omvat het blootstellen van zebravis embryo’s aan verschillende concentraties van chemische remmer verbindingen en het bestuderen van de sterfte en fenotypische veranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling. Aan het einde van de blootstelling aan de chemische verbindingen wordt de LC50 dosis van de chemische stof bepaald. De methode stelt een individu in staat om efficiënte screening van 1-5 test verbindingen uit te voeren en duurt ongeveer 8-10 uur, afhankelijk van de ervaring van de persoon met de methode (Figuur 1). Elk van de stappen die nodig zijn om de toxiciteit van de verbindingen te beoordelen, wordt beschreven in Figuur 2. De beoordeling van de toxiciteit van CA-remmers vereist 8 dagen, en omvat het instellen van parings paren (dag 1); inzameling van embryo’s uit kweek tanks, reiniging en overbrenging naar een broedplaats van 28,5 °C (dag 2); verdeling van de embryo’s in de putjes van een 24-putplaat en toevoeging van verdunde CA-remmer verbindingen (dag 3); Fenotypische analyse en beeldvorming van larven (dag 4-8), en bepaling van LC50 dosis (day8). Deze methode is snel en efficiënt, vereist een kleine hoeveelheid van de chemische verbinding en alleen basisvoorzieningen van het laboratorium.
In vitro toxiciteitstest met behulp van gekweekte cellen kan overleven en morfologische studies van de cellen die beperkte informatie over de toxiciteit geïnduceerd door de teststof te detecteren. Het voordeel van toxiciteits screening van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo’s is een snelle detectie van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in een heel dier tijdens de embryonale ontwikkeling in een relevant modelorganisme. Ongeveer 70% van de eiwit codering menselijke genen hebben …
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd gesteund door subsidies van Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Fins Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere Tuberculosefonds (SP, MH en MP) en Jane en Aatos Erkko Foundation (SP en MP ). We danken onze Italiaanse en Franse medewerkers, Prof. Supuran, en Prof. Winum, voor het leveren van koolzuuranhydraseremmers voor de veiligheid en toxiciteit bij de evaluatie van anti-TUBERCULOSE en anti-kankergeneesmiddelen ontwikkeling. Wij danken Aulikki Lehmus en Marianne Kuuslahti voor de technische bijstand. We bedanken ook Leena Mäkinen en Hannaleena Piippo voor hun hulp bij het fokken van zebravis en het verzamelen van embryo’s. We danken Harlan Barker oprecht voor de kritische evaluatie van het manuscript en inzichtelijke commentaren.
24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |