Быстрая оценка токсичности химических соединений с использованием эмбрионов зебры
Summary
Эмбрионы зебры используются для оценки токсичности химических соединений. Они развиваются внешне и чувствительны к химическим веществам, что позволяет обнаруживать тонкие фенотипические изменения. Эксперимент требует лишь небольшого количества соединения, которое непосредственно добавляется в пластину, содержащую эмбрионы, что делает систему тестирования эффективной и рентабельной.
Abstract
Зебрафиш является широко используемой позвоночной модели организма для болезни и фенотипа основе открытия наркотиков. Зебрафиш генерирует много потомства, имеет прозрачные эмбрионы и быстрое внешнее развитие. Таким образом, эмбрионы зебры могут также использоваться для быстрой оценки токсичности препаратов, которые являются ценными и доступны в небольших количествах. В настоящей статье описан метод эффективного скрининга токсичности химических соединений с использованием 1-5-дневных эмбрионов после оплодотворения. Эмбрионы контролируются стереомикроскопом для исследования фенотипических дефектов, вызванных воздействием различных концентраций соединений. Половина максимальных концентраций летальных (LC50) соединений также определены. Настоящее исследование требует 3-6 мг ингибиторного соединения, и весь эксперимент занимает около 8-10 ч, чтобы быть завершена человеком в лаборатории, имеющей основные средства. Текущий протокол подходит для тестирования любого соединения для выявления невыносимых токсичных или вне целевых эффектов соединения на ранней стадии обнаружения наркотиков и для обнаружения тонких токсических эффектов, которые могут быть пропущены в культуре клеток или других животных моделей. Метод сокращает процедурные задержки и затраты на разработку лекарств.
Introduction
Разработка лекарств является дорогостоящим процессом. Прежде чем одно химическое соединение одобрено Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) несколько тысяч соединений проверяются на сумму более одного миллиарда долларов1. Во время доклинической разработки, большая часть этой стоимости требуется для тестирования на животных2. Чтобы ограничить затраты, исследователям в области разработки лекарств необходимы альтернативныемодели для скрининга безопасности химических соединений 3. Поэтому на ранней стадии разработки препарата было бы очень полезно использовать метод, который может быстро оценить безопасность и токсичность соединений в подходящей модели. Есть несколько протоколов, которые были использованы для скрининга токсичности химических соединений с участием животных и клеточных моделей культуры, но нет ни одного протокола, который проверяется и является общим использованием4,5. Существующие протоколы с использованием зебры различаются по длине и былииспользованы отдельными исследователями, которые оценили токсичность в соответствии с их требованиями удобства 6,7,8,9, 10 Лет , 11 Год , 12.
В недавнем прошлом, зебрафиш стала удобной моделью для оценки токсичностихимических соединений во время эмбрионального развития 6,7. Зебрафиш имеет много встроенных преимуществ для оценки химических соединений13. Даже крупномасштабные эксперименты поддаются, так как самка зебры может откладывать партии по 200-300 яиц, которые быстро развиваются ex vivo,не нуждаются во внешнем кормлении до недели и прозрачны. Соединения могут быть добавлены непосредственно в воду, где они могут (в зависимости от характера соединения) диффундировать через хорион, и после вылупления, через кожу, жабры и рот личинок. Эксперименты не требуют большого количества химических соединений14 из-за небольшого размера эмбриона. Развитие эмбрионов зебры выражает большинство белков, необходимых для достижения нормального результата развития. Таким образом, эмбрион зебры является чувствительной моделью для оценки того, может ли потенциальный препарат нарушить функцию белка или сигнальной молекулы, которая имеет важное значение для развития. Органы зебры становятся функциональными между 2-5 dpf15, и соединения, которые являются токсичными в этот чувствительный период эмбрионального развития вызывают фенотипические дефекты в личинки зебры. Эти фенотипические изменения могут быть легко обнаружены с помощью простого микроскопа без инвазивных методов11. Эмбрионы зебрафиш широко используются в токсикологических исследованиях из-за их гораздо большей биологической сложности по сравнению с скринингом наркотиков in vitro с использованием моделей клеточной культуры16,17. Как позвоночных, генетический и физиологический состав зебры сопоставим с человеком и, следовательно, токсичность химических соединений похожи между зебрафиши и людей8,18,19, 20 , 21 год , 22. Зебрафиш, таким образом, является ценным инструментом на ранней стадии открытия наркотиков для оценки токсичности и безопасности химических соединений.
В настоящей статье мы предоставляем подробное описание метода, используемого для оценки безопасности и токсичности соединений ингибитора углеродной анигидразы (CA) с использованием 1-5-дневного послеоплодного оплодотворения (dpf) эмбрионов зебры одним исследователем. Протокол включает в себя подвергая эмбрионы зебры различным концентрациям химических ингибиторных соединений и изучая смертность и фенотипические изменения во время эмбрионального развития. В конце воздействия химических соединений, LC50 доза химического вещества определяется. Метод позволяет человеку проводить эффективный скрининг 1-5 испытательных соединений и занимает около 8-10 ч в зависимости от опыта человека с методом(рисунок 1). Каждый из шагов, необходимых для оценки токсичности соединений, изложен на рисунке 2. Оценка токсичности ингибиторов ЦА требует 8 дней и включает в себя настройку спаривающихпар (день 1); сбор эмбрионов из резервуаров для размножения, очистка и перенос их в инкубатор 28,5 градуса по Цельсию (день 2); распределение эмбрионов в колодцы 24-колодца пластины и добавление разбавленных ингибиторных соединений CA (день 3); фенотипический анализ и визуализация личинок (день 4-8), а также определение дозы LC50 (день8). Этот метод является быстрым и эффективным, требует небольшого количества химического соединения и только основные средства лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тест на токсичность in vitro с использованием культивированных клеток может обнаружить выживаемость и морфологические исследования клеток, предоставляющих ограниченную информацию о токсичности, индуцированной испытательным соединением. Преимуществом скрининга токсичности химич…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана грантами Фонда Сигрида Джузелиуса (SP, MP), Финского культурного фонда (AA, MH), Академии Финляндии (SP, MP), Фонда Ориона Фармоса (MH), Фонда тампере туберкулеза (SP, MH и MP) и Фонда Джейн и Аатоса Эркко (SP and MP ). Мы благодарим наших итальянских и французских коллег, профессора Супурана и профессора Винама, за предоставление ингибиторов углеродной анигидраззы для оценки безопасности и токсичности для целей разработки противотуберкулезных и противораковых препаратов. Мы благодарим Ауликки Лемуса и Марианну Кууслахти за техническую помощь. Мы также благодарим Лину Мякинен и Ханналину Пииппо за помощь в разведении зебры и сборе эмбрионов. Мы искренне благодарим Харлана Баркера за критическую оценку рукописи и глубокие комментарии.
Materials
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research–advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
