Sebrafisk embryo brukes for å evaluere toksisitet av kjemiske forbindelser. De utvikler seg eksternt og er følsomme for kjemikalier, slik at påvisning av subtile fenotypiske endringer. Eksperimentet krever bare en liten mengde sammensatte, som er direkte lagt til platen som inneholder embryo, noe som gjør testingen systemet effektiv og kostnadseffektiv.
Sebrafisk er en mye brukt virveldyr modell organisme for sykdommen og fenotype-baserte narkotika funn. Sebrafisk genererer mange avkom, har transparent embryo og rask ekstern utvikling. Sebrafisk embryo kan derfor også brukes til rask evaluering av toksisitet av legemidler som er dyrebare og tilgjengelige i små mengder. I denne artikkelen er en metode for effektiv screening av toksisitet av kjemiske forbindelser med 1-5-dagers post befruktning embryo beskrevet. Embryo overvåkes av stereomikroskopet å undersøke fenotypiske defekter forårsaket av eksponering for ulike konsentrasjoner av forbindelser. Halv-maksimal dødelige konsentrasjoner (LC50) av forbindelsene er også bestemt. Den nåværende studien krevde 3-6 mg av en inhibitor sammensatt, og hele eksperimentet tar ca 8-10 h skal fylles ut av en person i et laboratorium har grunnleggende fasiliteter. Den nåværende protokollen er egnet for å teste alle sammensatte å identifisere uutholdelig giftig eller off-Target effekter av sammensatt i den tidlige fasen av stoffet funnet og å oppdage subtile toksiske effekter som kan være savnet i cellen kultur eller andre dyremodeller. Metoden reduserer prosessuelle forsinkelser og kostnader ved narkotika utvikling.
Drug utvikling er en kostbar prosess. Før en enkelt kjemisk sammensatt er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og European legemiddel Agency (EMA) flere tusen forbindelser er vist til en kostnad på over 1 000 000 000 dollar1. Under prekliniske utvikling, er den største delen av denne kostnaden som kreves for dyret testing2. For å begrense kostnadene, forskere innen narkotika utvikling trenger alternative modeller for sikkerhet screening av kjemiske forbindelser3. Derfor, i den tidlige fasen av stoffet utvikling, det ville være svært gunstig å bruke en metode som raskt kan evaluere sikkerhet og toksisitet av forbindelsene i en passende modell. Det er flere protokoller som har blitt brukt for toksisitet screening av kjemiske forbindelser som involverer dyr og cellekultur modeller, men det er ikke en enkelt protokoll som er validert og er i felles bruk4,5. Eksisterende protokoller som bruker sebrafisk varierer i lengde og har blitt brukt av individuelle forskere som evaluerte toksisitet som per deres bekvemmelighet kravet6,7,8,9, 10 andre , 11 flere , Det er 12.
I den siste tiden har sebrafisk dukket opp som en praktisk modell for evaluering av toksisitet av kjemiske forbindelser under embryonale utviklingen6,7. Sebrafisk har mange innebygde fordeler for evalueringen av kjemiske forbindelser13. Selv store eksperimenter er mottagelig, som en sebrafisk kvinne kan legge grupper av 200-300 egg, som utvikler raskt ex vivo, trenger ikke ekstern fôring i opptil en uke og er gjennomsiktige. Forbindelsene kan legges direkte i vannet, hvor de kan (avhengig av arten av sammensatte) diffus gjennom chorionic, og etter klekking, gjennom huden, gjellene og munningen av larver. Eksperimentene krever ikke store mengder kjemiske forbindelser14 på grunn av den lille størrelsen på fosteret. Utvikle sebrafisk embryo uttrykker det meste av proteiner som kreves for å oppnå normal utviklingsmessige utfallet. Derfor er et sebrafisk embryo en følsom modell for å vurdere om et potensielt legemiddel kan forstyrre funksjonen til et protein eller signaliserer molekyl som er developmentally signifikant. Organene i sebrafisk blir funksjonelle mellom 2-5 DPF15, og forbindelser som er giftige i løpet av denne sensitive perioden av embryonale utviklingen induserer fenotypiske defekter i sebrafisk larver. Disse fenotypiske endringene kan lett oppdages ved hjelp av et enkelt mikroskop uten invasive teknikker11. Sebrafisk embryo er mye brukt i toksikologiske undersøkelser på grunn av deres mye større biologisk kompleksitet sammenlignet med in vitro Drug screening ved hjelp av cellekultur modeller16,17. Som virveldyr, genetisk og fysiologiske makeup av sebrafisk er sammenlignbare med mennesker og dermed toksisitet av kjemiske forbindelser er lik mellom sebrafisk og mennesker8,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22. sebrafisk er således et verdifullt redskap i den tidlige fasen av narkotika funnet for evalueringen av toksisitet og sikkerheten til de kjemiske forbindelsene.
I denne artikkelen gir vi en detaljert beskrivelse av metoden som brukes for å evaluere sikkerhet og toksisitet av Karbons karboanhydrasehemmere (CA) inhibitor forbindelser med 1-5-dagers post befruktning (DPF) sebrafisk embryo av en enkelt forsker. Protokollen innebærer å utsette sebrafisk embryo til ulike konsentrasjoner av kjemisk inhibitor forbindelser og studere dødelighet og fenotypiske endringer i løpet av embryoutvikling. På slutten av eksponeringen til kjemiske forbindelser, er LC50 dose av kjemiske bestemmes. Metoden gjør det mulig for en person å utføre effektiv screening av 1-5 test forbindelser og tar ca 8-10 h avhengig av opplevelsen av personen med metoden (figur 1). Hvert av trinnene som kreves for å vurdere toksisitet av forbindelsene er skissert i figur 2. Evalueringen av toksisitet av CA-hemmere krever 8 dager, og omfatter oppsett av parring par (dag 1); samling av embryo fra avl tanker, rengjøring og overføre dem til 28,5 ° c inkubator (dag 2); distribusjon av embryo inn i brønnene av en 24-brønn plate og tillegg av utvannet CA inhibitor forbindelser (dag 3); fenotypiske analyse og bilde av larver (dag 4-8), og bestemmelse av LC50 dose (day8). Denne metoden er rask og effektiv, krever en liten mengde av den kjemiske forbindelsen og bare grunnleggende fasiliteter i laboratoriet.
I vitro toksisitet test ved hjelp av kulturperler celler kan oppdage overlevelse og morfologiske studier av cellene gir begrenset informasjon om toksisitet indusert av testen sammensatte. Fordelen med toksisitet screening av kjemiske forbindelser ved hjelp sebrafisk embryo er rask påvisning av kjemisk indusert fenotypiske endringer i et helt dyr under embryonale utviklingen i en relevant modell organisme. Ca 70% av protein-koding menneskelige gener har orthologs kolleger i sebrafisk Genova25</…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), finsk Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere tuberkulose Foundation (SP, MH og MP) og Jane og langgong Erkko Foundation (SP og MP ). Vi takker våre italienske og franske samarbeidspartnere, Prof Supuran, og Prof Grønsdal, for å gi Karbons karboanhydrasehemmere hemmere for sikkerhet og toksisitet evaluering for anti-TB og anti-kreft narkotika utvikling formål. Vi takker Aulikki Lehmus og Marianne Kuuslahti for teknisk assistanse. Vi takker også Leena Mäkinen og Hannaleena utslått for deres hjelp med sebrafisk avl og samling av embryo. Vi oppriktig takker Harlan Barker for kritisk vurdering av manuskriptet og innsiktsfulle kommentarer.
24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |