היווצרות חומר של משי רקומביננטי עכביש באמצעות מימית Solvation באמצעות חום ולחץ
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מסיסים במים רקומביננטי עכביש משי פתרונות חלבון וצורות חומרים שניתן ליצור מאותם פתרונות.
Abstract
עכבישים רבים מייצרים. שבעה סוגי משי שישה מבדי המשי הם סיבים בצורה כאשר מופק על ידי העכבישים. הסיבים האלה אינם מסיסים במים. על מנת לשכפל את תכונות מכני יוצא דופן של משי עכביש, הם חייבים להיות מיוצר הטרוולוגי מארחים כמו עכבישים הם טריטוריאליים ו קניבאלי. האנלוגיות הסינתטית של משי העכביש נוטות גם הם להיות מסיסים בפתרונות מימית. כך, אחוז גדול של מחקר בדי משי רקומביננטי עכביש להסתמך על ממיסים אורגניים כי הם מזיקים ייצור בקנה מידה גדול של חומרים. שיטת הקבוצה שלנו מאלצת את הרקומביננטי של משי העכביש למים. באופן מדהים, כאשר חלבונים אלה מוכנים באמצעות שיטה זו של חום ולחץ, מגוון רחב של צורות חומר ניתן להכין מאותו פתרון של חלבונים משי רקומביננטי עכביש (rSSp) כולל: סרטים, סיבים, ספוג, הידרוג’ל, lyogel, ו דבקים. מאמר זה מדגים את הייצור של rSSp וצורות חומרים באופן שניתן להבינו בקלות רבה יותר מאשר חומרים כתובים ושיטות בלבד.
Introduction
משי עכביש צברה לטובת מדענים חומריים על השילוב המרשים שלהם של חוזק, אלסטיות, ו biocompatibility. משחזר סיבים היתה באופן מסורתי הדחף של המחקר. מאמץ זה הושפע חלבון רקומביננטי עכביש משי (rSSp) חוסר מסיסות במים, כמו גם חוסר יכולת של טכניקות שימור מסורתי (סוכנים chaotropic וחומרי ניקוי) כדי להשיג שימור מימית. עוד, טכניקות שפותחו עבור גירסאות solvating של rssp לא לעבוד על כל משתני rssp וגם דורשים מניפולציה משמעותית זמן שלעיתים קרובות תוצאות אובדן חלבון1,2. זה הביא בעיקר בתחום ניצול 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroגנול (HFIP) כממס שממנו ליצור סיבים, וצורות חומרים מוגבלים אחרים. היתרון הוא כי כל rSSp ידוע מסיסים ב HFIP, מתן אחידות נתונים בין כל קבוצת מחקר. החיסרון הוא כי HFIP היא הממס הרעיל כי הוא יקר ומעשי לקנה מידה עקב חששות בריאותיים ושיקולים סביבתיים.
הגישה הרומן של rSSp שימור פותחה כי גישור את הפער הטכנולוגי בין הממס האורגני הקשה HFIP וטכניקות אחרות שעבדו באופן סלקטיבי עבור rSSp שימור. השילוב של מחמם ולחצים ספציפיים הוחל על השעיות של rSSp ומים. התוצאות היו בקרבת 100% שימור והתאוששות של rSSp, כמו גם ריכוזי חלבונים גבוהים; מגוון של צורות חומרים היו נחושים להיות אפשריים מניסוחים אלה שלא היו כל השגה באמצעות hfip או ממיסים אורגניים אחרים3,4,5,6. המטרה של גישה זו היא ביעילות ובקלות מסיסות מטוהרים ומיובשים רקומביננטי spider חלבונים בפתרון מימית כי יכול להיות מנוצל לייצור של מגוון צורות חומרים.
סיבים, סרטים, ציפויים, דבקים, הידרוג’לים, lyogels, microspheres, וחומרי ספוג הם כל בקלות accomplishable מתוך הפתרון rSSp מימית אותו באמצעות שיטה זו. המשך האבולוציה של שיטה זו, לא רק עם rSSp נוספים אלא עם חלבונים אחרים, יכול להוביל לצורות חומר חדשות ולטיהור חלבון אלטרנטיבי ושדרות מסיסות.
Protocol
Representative Results
Discussion
לאחר רקומביננטי החלבונים משי עכביש מטוהרים הם צריכים אז להיות מוכנים בפתרון כי ניתן להשתמש עבור היווצרות חומר. על-ידי ערבוב חלבון המשי של קורי העכביש עם מים וחשיפת תערובת זו להקרנה מיקרוגל, כדי ליצור חום ולחץ, ניתן להכין פתרון rSSp. ניתן להפיק מגוון רחב של צורות חומריות משיטה פשוטה ויעילה זו …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים לקבל בהכרת תודה מימון של יוטה מדע וטכנולוגיה מחקר (USTAR) יוזמה.
Materials
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
