열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성
Summary
여기서, 우리는 수용 성 재조합 거미 실크 단백질 용액 및 그 용액 으로부터 형성 될 수 있는 물질 형태를 생산 하는 프로토콜을 제시 한다.
Abstract
많은 거미 들이 일곱 종류의 실크를 생산 합니다. 6 개의 실크는 거미에 의해 생성 된 형태로 섬유입니다. 이 섬유는 수용 성이 없습니다. 거미 실크의 놀라운 기계적 성질을 재현 하기 위해, 거미는 영토와 식인 것으로 서 이종의 호스트에서 생산 되어야 합니다. 거미 실크의 합성 유사 체는 또한 수 용액에 불용 성 경향이 있다. 따라서, 재조합 거미 실크 연구의 많은 비율은 물질의 대규모 생산에 해로운 유기 용 매에 의존. 우리 그룹의 방법은 이러한 재조합 거미 실크의 용 매를 물에 강제로. 놀랍게도 이러한 열과 압력 방법을 사용 하 여 이러한 단백질을 제조할 때 필름, 섬유, 스폰지, 하이드로 겔, lyogel 및 접착제를 포함 한 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp)의 동일한 용액 으로부터 다양 한 물질 형태를 제조할 수 있습니다. 본 문서는 서 면 재료 및 방법 만으로는 보다 쉽게 이해 되는 방식으로 용 매 화 rSSp 및 재료 형태를 생산 하는 것을 보여줍니다.
Introduction
거미 실크는 강도, 탄력성 및 생체 적합성의 인상적인 조합에 대 한 재료 과학자의 관심을 얻고 있다. 섬유를 다시 만드는 것은 전통적으로 연구의 추력 이었다. 이러한 노력은 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp) 물에 대 한 용해성 뿐만 아니라 전통적인 용 매 화 기술 (차오 트로픽 제 및 세제)의 무 능력으로 수성 용 매를 달성 함으로써 방해를 받았습니다. 또한 rssp의 용 매 화 버전을 위해 개발 된 기술은 모든 rssp 변형에서 작동 하지 않으며, 종종 단백질 손실1,2를 초래 하는 상당한 조작 및 시간이 필요 합니다. 이는 주로 섬유를 형성 하는 용 매로 서 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 사용 하는 분야에서, 그리고 다른 한정 된 물질 형태를 초래 하였다. 모든 알려진 rSSp가 HFIP에 용 해 되어 각 연구 그룹 간의 데이터 균일성을 제공 한다는 이점이 있습니다. 단점은 HFIP가 건강 문제와 환경적 고려 사항으로 인해 규모가 비싸고 실용적이 지 않은 독성 용 매 라는 점입니다.
Rssp 용 매 화에 대 한 신규 한 접근법이 개발 되어, rSSp 용 매가 선택적으로 작동 하는 가혹한 유기 용 제 HFIP 및 기타 기술 들 사이의 기술적 간극이 브릿지 되었다. 특정가 열 및 압력의 조합은 rSSp와 물의 현 탁 액에 적용 되었습니다. 결과는 100%의 용 매 화 및 rSSp의 회수 뿐만 아니라 고 단백질 농도와도 같습니다. 다양 한 물질 형태가 hfip 또는 다른 유기 용 매를 사용 하 여 달성할 수 없었던 이들 제제 로부터 가능 하다 고 결정 되었다3,5,6. 이러한 접근법의 목적은 정제 및 건조 된 재조합 거미 단백질을 수 용액에 효율적이 고 용이 하 게 가용 화 하 여 다양 한 재료 형태의 생산을 위해 활용 하는 것 이다.
섬유, 필름, 코팅, 접착제, 하이드로 겔, lyogels, 마이크로 스피어 및 스폰지 물질은 모두이 방법을 사용 하 여 동일한 수성 rSSp 솔루션에서 쉽게 accomplishable. 추가 rSSp 뿐만 아니라 다른 단백질과 함께이 방법의 지속적인 진화는 새로운 물질 형태와 대체 단백질 정제 및 가용 화로 이어질 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
재조합 거미 실크 단백질이 정제 된 후에는 물질 형성에 사용 될 수 있는 용액으로 제조 되어야 한다. 동결 건조 된 거미 실크 단백질을 물과 혼합 하 고이 혼합물을 마이크로파 조사에 노출 시 킴으로써, 열 및 압력을 발생 시키고, rSSp 용액을 제조할 수 있다. RSSp 가용 화의 간단 하 고 효율적인 방법으로 다양 한 재료 형태를 생산할 수 있습니다. 각 재료는 원하는 결과와 특성을 달성 하기 위해 고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 들은 유타 과학 기술 연구 (USTAR) 이니셔티브의 자금을 기꺼이 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
