Purificazione e trapianto di cellule progenitrici Myogenic derivato esosomi per migliorare la funzione cardiaca nei topi distrofici muscolare di Duchenne
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la funzione cardiaca nei topi di distrofia muscolare di Duchenne transitoriamente trapiantando esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic normale.
Abstract
Duchene distrofia muscolare (DMD) è una malattia genetica recessiva legata al X causata da una mancanza di distrofina funzionale. La malattia non può essere curata, e come la malattia progredisce, il paziente sviluppa sintomi di scompenso cardiaco, aritmia e cardiomiopatia dilatativa. I topi mutanti DMDMDX non esprimono distrofina e sono comunemente usati come un modello murino di DMD. Nel nostro recente studio, abbiamo osservato che l’iniezione intramiocardica di tipo largo (WT)-esosomi derivato da cellule progenitrici myogenic (MPC-Exo) ripristino transitoriamente l’espressione di distrofina nel miocardio dei topi mutanti DMDMDX , che è stato associato con un miglioramento transitorio nella funzione cardiaca suggerendo che WT-MPC-Exo può fornire un’opzione per alleviare i sintomi cardiaci di DMD. Questo articolo descrive la tecnica di purificazione di MPC-Exo e trapianto nei cuori dei topi mutanti DMDMDX .
Introduction
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una X-linked recessiva neuromuscolare malattia progressiva causata da una mutazione nel gene DMD e la perdita di distrofina funzionale1. Distrofina è espresso principalmente nel miocardio e nel muscolo scheletrico e meno è espressa nel muscolo liscio, ghiandole endocrine e neuroni2,3. DMD è il tipo più comune di distrofia muscolare con un’incidenza di uno per 3.500 a 5.000 ragazzi neonato in tutto il mondo4,5. Gli individui si sviluppano tipicamente necrosi progressiva del muscolo, perdita della deambulazione indipendente dalla prima adolescenza e morte nei decenni della loro vita a causa di scompenso cardiaco e insufficienza respiratoria6secondo al terzo.
Cardiomiopatia dilatativa, aritmie e scompenso cardiaco sono manifestazioni comuni cardiovascolare di DMD7,8. La malattia non può essere curata, trattamento di supporto può migliorare i sintomi o ritardare la progressione dell’insufficienza cardiaca, ma è molto difficile migliorare il cuore funzione9,10.
Simile ai pazienti di DMD, distrofia muscolare X-collegata (MDX) topi sono carenti di distrofina e presenti sintomi di cardiomiopatia11e di conseguenza sono ampiamente usati nella DMD associata cardiomiopatia ricerca. Al fine di ripristinare la distrofina in muscoli commoventi, terapia di trapianto allogeneic della cellula formativa ha dimostrato di essere un efficace trattamento per DMD12,13,14. Esosomi, vescicole di membrana di 30-150 nm secernute da vari tipi cellulari, svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula–cellula attraverso il trasporto di materiale genetico, come RNA messaggero (mRNA) e non-codificazione RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nostri studi precedenti hanno dimostrato che gli esosomi derivati da cellule progenitrici myogenic (MPC), ad esempio linea di cellule C2C12, possono trasferire dystrophin mRNA a host cardiomiociti dopo iniezione cardiaca diretta22, che indica quella consegna allogenico di MPC-derivato esosomi (MPC-Exo) possono ripristinare transitoriamente DMD espressione genica nei topi MDX. Questo articolo si concentra su tecniche di purificazione e trapianto di MPC-Exo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di isolamento esosomi puri è essenziale per studiare la funzione di esosomi. Una delle tecniche comuni per l’isolamento di esosomi è polietilenglicoli (pioli) mediate precipitazioni17,18,25. Esosomi possono essere precipitati in pioli e pellettati mediante centrifugazione a bassa velocità. PEG-mediata di purificazione è molto conveniente, basso costo, non ha bisogno di qualsiasi attrezzatura avanzata, ma c’è preoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang erano parzialmente supportato dall’associazione americana del cuore: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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