Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para mejorar transitoriamente la función cardiaca en ratones de la distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exosomas derivados de células progenitoras miógena normal.
Abstract
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética recesiva x-ligada causada por una carencia de la proteína distrofina funcional. No se puede curar la enfermedad, y conforme avanza la enfermedad, el paciente desarrolla síntomas de insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía dilatada y arritmias. Los ratones mutantes DMDMDX no expresan distrofina y se utilizan comúnmente como un modelo de ratón de la DMD. En nuestro reciente estudio, se observó que la inyección intramiocárdica de tipo ancho (WT)-progenitor miógena exosomas derivados de células (MPC-Exo) transitoriamente restauran la expresión de distrofina en el miocardio de ratones mutantes DMDMDX , asociada con una mejora transitoria de la función cardiaca, lo que sugiere que WT-MPC-Exo puede proporcionar una opción para aliviar los síntomas cardiacos de la DMD. Este artículo describe la técnica de purificación de MPC-Exo y el trasplante en corazones de ratones mutantes DMDMDX .
Introduction
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una X-ligado recesiva, progresiva enfermedad neuromuscular causada por una mutación en el gen de la DMD y la pérdida de distrofina funcional1. Distrofina se expresa principalmente en el miocardio y músculo esquelético y menos se expresa en el músculo liso, glándulas endocrinas y neuronas2,3. DMD es el tipo más común de distrofia muscular con una incidencia de uno por cada 3.500 a 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo4,5. Individuos suelen desarrollan necrosis muscular progresiva, pérdida de independiente a pie en la adolescencia temprana y la muerte en las décadas de segunda a tercera de sus vidas debido a la insuficiencia cardíaca y la insuficiencia respiratoria6.
Miocardiopatía dilatada, arritmias e insuficiencia cardíaca congestiva son manifestaciones cardiovasculares comunes de DMD7,8. No se puede curar la enfermedad, tratamiento de apoyo puede mejorar los síntomas o retrasar la progresión de la insuficiencia cardíaca, pero es muy difícil mejorar la función de corazón9,10.
Similares para los pacientes con DMD distrofia muscular X-ligado (MDX) ratones son deficientes en la proteína de distrofina y presente síntomas de cardiomiopatía11y por lo tanto son ampliamente utilizados en la investigación DMD asociado miocardiopatía. Con el fin de restaurar la distrofina en los músculos afectados, terapia de células madre alogénico ha demostrado para ser un eficaz tratamiento para la DMD12,13,14. Exosomas, vesículas de membrana 30-150 nm secretadas por varios tipos celulares, juegan un papel clave en la comunicación de célula a célula a través de transporte de material genético, ARN mensajero (ARNm) como no-codificación RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nuestros estudios previos han demostrado que los exosomas derivados de células progenitoras miógeno (MPC), como línea de celular C2C12, pueden transferir dystrophin mRNA al host cardiomiocitos después de inyección cardiaca directa22, indicando que entrega alogénico de Exosomas derivados de MPC (MPC-Exo) transitorio pueden restaurar la expresión del gen DMD en ratones MDX. Este artículo se centra en técnicas de purificación y trasplante MPC-Exo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de aislamiento de exosomas pura es esencial para el estudio de la función de exosomas. Una de las técnicas comunes para el aislamiento de exosomas es polietilenglicoles (PEGs) mediada por precipitación17,18,25. Exosomas pueden ser precipitada en las clavijas y peleteado por centrifugación a baja velocidad. Mediada por PEG purificación es muy conveniente y de bajo costo, no necesita ningún equipo avanzado, pero h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang fue parcialmente financiado por la American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, HL134354 de NIH.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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