Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra normalnivå hjärtfunktion hos Duchennes muskeldystrofi möss genom omplantering exosomes härrör från normala myogenic stamceller.
Duchene muskeldystrofi (DMD) är en X-bunden recessiv genetisk sjukdom orsakas av en brist på funktionella dystrofin protein. Sjukdomen kan inte botas, och eftersom sjukdomen fortskrider, patienten utvecklar symtom av dilaterad kardiomyopati, arytmi och hjärtsvikt. DMDMDX muterade mössen uttrycker inte dystrofin, och används ofta som en musmodell av DMD. I vår senaste studie, vi konstaterade att intramyocardial injektion av brett typ (WT)-myogenic progenitor celler-derived exosomes (MPC-Exo) övergående återställd uttrycket av dystrofin i myokardiet av DMDMDX muterade möss, som förknippades med övergående förbättring av hjärtfunktionen tyder på att föreskriva WT-MPC-Exo en möjlighet att lindra hjärt symptomen av DMD. Denna artikel beskriver tekniken av MPC-Exo rening och transplantation in i hjärtan av DMDMDX muterade möss.
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en X-bunden recessiv, progressiv neuromuskulär sjukdom orsakas av en mutation i genen DMD och förlusten av funktionella dystrofin1. Dystrofin uttrycks framförallt skelettmuskulatur och hjärtmuskeln och uttrycks mindre i glatt muskulatur, endokrina körtlar och nervceller2,3. DMD är den vanligaste typen av muskeldystrofi med en incidens av en per 3 500 till 5.000 nyfödda pojkar världen över4,5. Individer utvecklar vanligen progressiva muskel nekros, förlust av oberoende walking av tidiga tonåren, och död i andra till tredje årtionden av sina liv på grund av hjärtsvikt och andningssvikt6.
Dilaterad kardiomyopati, arytmier och hjärtsvikt är vanligt hjärt-manifestationer av DMD7,8. Sjukdomen kan inte botas, understödjande behandling kan förbättra symtom eller fördröja utvecklingen av hjärtsvikt, men det är mycket svårt att förbättra hjärtat funktion9,10.
Liknar DMD patienter, X-länkade muskeldystrofi (MDX) möss är bristfällig i dystrofin protein och nuvarande symtom på kardiomyopati11, och används därför ofta i DMD associerade kardiomyopati forskning. För att återställa dystrofin i drabbade muskler, har allogen stamcellsterapi visat sig vara en effektiv behandling för DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membranet blåsor utsöndras av olika celltyper, spela en nyckelroll i cell-till-cell kommunikation genom genetiska materialtransport, såsom budbärar-RNA (mRNA) och icke-kodande RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Våra tidigare studier har visat att exosomes härstammar från myogenic stamceller (MPC), såsom C2C12 cellinje, kan överföra dystrofin mRNA till värd hjärtmuskelcellerna efter hjärt direktinsprutning22, vilket indikerar att allogen leverans av MPC-derived exosomes (MPC-Exo) kan övergående återställa DMD genuttryck i MDX-möss. Denna artikel fokuserar på MPC-Exo rening och transplantation tekniker.
Metoden att isolera ren exosomes är viktigt för att studera funktionen av exosomes. En av de vanliga teknikerna för exosome isolering är polyeten glykoler (pinnar) medierad nederbörd17,18,25. Exosomes kan vara fällt i pinnar och pelleterat låg hastighet centrifugering. PEG-medierad rening är mycket bekvämt, låg kostnad, det behöver inte någon avancerad utrustning, men det finns oro över renheten hos exosomes efterso…
The authors have nothing to disclose.
Tang stöttades delvist av American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
Centrifuge | Unico | C8606 | |
Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
DMEM | Corning | 10-013-CM | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |