Nous présentons un assay de traction de haut débit fabriqué avec le caoutchouc de silicone (PDMS). Ce nouvel exemple est approprié pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus et maladies biologiques et biomédicaux. Nous démontrons l’utilité de cette méthode en mesurant une augmentation dépendante de TGF-MD de contractilité pendant la transition épithélial-à-mesenchymal.
La contractilité cellulaire est essentielle dans divers aspects de la biologie, les processus de conduite qui vont de la motilité et la division, à la contraction des tissus et la stabilité mécanique, et représente un élément central de la vie animale multicellulaire. Dans les cellules adhérentes, la contraction de l’acto-myosine est observée dans les forces de traction que les cellules exercent sur leur substrat. La dysrégulation de la contractilité cellulaire apparaît dans une myriade de pathologies, faisant de la contractilité une cible prometteuse dans diverses approches diagnostiques utilisant la biophysique comme mesure. En outre, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être basées sur la correction du dysfonctionnement apparent de la contractilité cellulaire. Ces applications, cependant, nécessitent une quantification directe de ces forces.
Nous avons développé la microscopie à base d’élastomère de silicone (TFM) dans un format multi-puits parallallé. Notre utilisation d’un caoutchouc de silicone, en particulier le polydiméthylsiloxane (PDMS), plutôt que le polyacrylamide hydrogel couramment utilisé (PAA) nous permet de fabriquer des substrats robustes et inertes avec des durées de conservation indéfinies ne nécessitant pas de conditions de stockage spécialisées. Contrairement aux approches basées sur le pilier-PDMS qui ont un modulus dans la gamme GPa, le PDMS utilisé ici est très conforme, allant d’environ 0,4 kPa à 100 kPa. Nous créons une plate-forme à haut débit pour TFM en cloisonnant ces grands substrats monolithiques spatialement en puits biochimiques indépendants, créant une plate-forme multi-puits pour le criblage de force de traction qui est compatible avec les systèmes multi-puits existants.
Dans ce manuscrit, nous utilisons ce système de force de traction multi-puits pour examiner la transition épithéliale à mésenchymale (EMT); nous induisons l’EMT dans les cellules De MNO en les exposant au TGF-MD, et en quantifiant les changements biophysiques pendant l’EMT. Nous mesurons la contractilité en fonction de la concentration et de la durée de l’exposition au TGF-MD. Nos résultats ici démontrent l’utilité du TFM parallallé dans le contexte de la biophysique de maladie.
La contractilité acto-myosine est un élément essentiel de la mécanique cellulaire active, ayant un impact sur les comportements cellulaires de la motilité et la prolifération à la différenciation des cellules souches. Dans les tissus, la contractilité entraîne l’activité de la séparation polaire dans l’embryogenèse, à la constriction des voies respiratoires et à l’activité cardiaque. De façon critique, pour générer de la tension, les cellules doivent d’abord adhérer à leur environnement extracellulaire. Ce faisant, cette contractilité génère des forces de traction sur leur environnement. La microscopie de traction force (TFM) a émergé sous une multitude de formes comme un moyen de quantifier ces forces à partir de cellules diverses dans des conditions différentes.
Le domaine de TFM a vu une ampleur exceptionnelle de l’innovation et de l’application, et les résultats ont ouvert la voie à de nouvelles perspectives en biologie, qui intègrent la mécanique et les forces physiques. En commençant par froisser les substrats de silicone1, les chercheurs ont appliqué diverses techniques pour mesurer les forces de traction cellulaire. Ces approches ont été continuellement améliorées et ont maintenant atteint un niveau de résolution de l’ordre de plusieurs microns2. Cependant, un problème principal est apparu, qui est la difficulté à créer des substrats de moduli convenablement faible en utilisant les silicones disponibles. Pour contourner ce problème, le polyacrylamide a été adopté comme un remplacement en raison de la facilité de créer des substrats de l’ordre de 1-20 kPa3. Nous avons récemment mis en œuvre des silicones très conformes dans TFM4, nous permettant de fabriquer la même gamme de moduli que le polyacrylamide, mais avec les avantages de silicone inerte et robuste.
Les approches DE la TFM ont permis de précieuses découvertes mécano-biologiques, cependant, une lacune persistante est leur complexité, limitant souvent leur utilisation aux chercheurs dans les disciplines de l’ingénierie ou des sciences physiques. Cela est dû en grande partie aux étalonnages détaillés et aux calculs difficiles qui sont nécessaires pour quantifier la contractilité. Un autre défi important est que les méthodes de TFM sont en grande partie à faible débit et donc mal adaptées pour étudier de nombreuses conditions ou populations différentes simultanément5. Cela a présenté un goulot d’étranglement, qui a entravé le transfert de TFM d’un établissement biophysique spécialisé dans des applications biologiques et pharmacologiques plus larges.
Nous avons récemment mis au point une plaque TFM multi-bien format, qui permet aux chercheurs de paralléliser leurs mesures TFM pour une quantification plus rapide des mesures de contractilité, tout en explorant l’impact de différents composés et en utilisant moins de réactifs4 . Cette méthodologie a une grande utilité dans diverses études de mécanobiologie, de l’évaluation des effets des composés sur l’activité cellulaire, à la quantification des changements contractuels dans la différenciation ou la maladie.
Un domaine de recherche biomédicale qui bénéficiera grandement de la TFM est l’étude de l’impact des indices physiques sur les phénotypes malins des cellules cancéreuses. La métastasie, responsable de 90% des décès liés au cancer, est caractérisée par des cellules cancéreuses quittant leur site tumoral d’origine et colonisant un site secondaire. Pour que les cellules migrent à travers les tissus et passent dans et hors du système vasculaire, elles doivent changer radicalement leurs formes pour se faufiler à travers ces barrières physiques tout en générant des forces substantielles pour tirer leur chemin le long de la matrice extracellulaire ou se déplacer entre les autres Cellules. Ces forces sont transmises au substrat par des interactions d’adhérence focale2,3, et peuvent être quantifiées à l’aide de TFM. Tandis que les cancers sont biochimiquement exceptionnellement divers, avec un répertoire croissant des mutations connues et des changements de protéine, quelques changements physiques communs ont été observés ; dans une variété de cancers, y compris les cancers du sein, de la prostate et du poumon, les cellules métastatiques ont été montrées pour exercer 2-3 fois les forces de traction des cellules non métastatiques6,7,8. Ces résultats suggèrent qu’il puisse y avoir une forte corrélation entre la progression métastatique et les forces de traction exercées par les cellules ; toutefois, il est difficile d’examiner les changements détaillés liés au temps dans la passéentité.
La transition épithéliale-à-mesenchymal (EMT) est un processus par lequel les cellules réduisent l’adhérence des cellules médiées par les adhérents et la jonction serrée, devenant plus migratrices et envahissantes. En plus des fonctions physiologiques qui incluent la cicatrisation des plaies et les processus de développement, l’EMT est également un processus exploité pendant la métastes, ce qui en fait un système modèle utile pour étudier ce processus. À l’aide de TGF-MD, nous pouvons induire l’EMT dans les cellules épithéliales mammaires maurines (NMuMG)9 pour quantifier directement les changements physiques au cours de cette transformation, et caractériser les effets dépendants du temps et de la dose de TGF-MD sur l’EMT et la contractilité cellulaire. Dans cet article, nous démontrons l’utilité de cette approche en mesurant les changements dans la contractilité pendant un EMT induit.
Pour le succès de cette méthode, il est essentiel d’avoir un échantillon uniformément enduit d’une épaisseur constante d’environ 100 m. Le modulus doit être soigneusement choisi pour examiner la signification physique du système biologique d’intérêt. Lors de la fabrication d’une couche supérieure, la concentration des particules fluorescentes fiduciales doit être optimisée pour une analyse précise du déplacement et du stress de traction. L’analyse des cellules individuelles isolées nécessite une couche fi…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Tom Kodger, Michael Landry et Christopher J. Barrett de leur aide dans la synthèse des perles. A.J.E. reconnaît que le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie accorde des subventions RGPIN/05843-2014 et EQPEQ/472339-2015, la subvention des Instituts de recherche en santé du Canada no 143327, la subvention de la Société canadienne du cancer no 703930 et la Fondation canadienne pour l’innovation Projet #32749. R. Krishnan reconnaît la subvention no des National Institutes of Health. R21HL123522 et R01HL136209. H.Y. a reçu l’appui du Fonds de recherche Santé Québec et du Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Les auteurs remercient Johanan Idicula pour son aide avec la vidéo et le manuscrit et Zixin He pour l’aide dans la préparation de la vidéo.
Plate | |||
GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
Surface Coating | |||
Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Cell Culture | |||
DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
Bead Synthesis | |||
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
Equipment | |||
Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |