Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal
Summary
Apresentamos um ensaio de força de tração de alta produtividade fabricado com borracha de silicone (PDMS). Este novo ensaio é adequado para o estudo de alterações físicas na contratilidade celular durante vários processos biológicos e biomédicos e doenças. Nós demonstramos a utilidade deste método medindo um aumento dependente TGF-β na contractilidade durante a transição epithelial-à-mesenchymal.
Abstract
A contratilidade celular é essencial em diversos aspectos da biologia, conduzindo processos que vão desde a motilidade e divisão, à contração tecidual e estabilidade mecânica, e representa um elemento central da vida animal multicelular. Nas células aderentes, a contração do acto-miosina é observada nas forças de tração que as células exercem em seu substrato. A desregulação da contratilidade celular aparece em uma infinidade de patologias, tornando a contratilidade um alvo promissor em diversas abordagens diagnósticas utilizando biofísica como métrica. Além disso, as estratégias terapêuticas novas podem ser baseadas em corrigir o mau funcionamento aparente da contratilidade da pilha. Estas aplicações, no entanto, exigem a quantificação direta dessas forças.
Nós desenvolvemos o silicone elastomer-baseou a microscopia da força da tração (TFM) em um formato multi-bem paralelizado. Nosso uso de uma borracha de silicone, especificamente o polidimetilsiloxano (PDMS), um pouco do que o poliacrilamida comumente empregado do hidrogel (PAA) permite-nos de fazer carcaças robustas e inertes com prateleira-vidas indefinidas que não exigem nenhumas condições de armazenamento especializadas. Diferentemente das abordagens baseadas em Pilar-PDMS que têm um módulo na faixa GPa, o PDMS usado aqui é muito compatível, variando de aproximadamente 0,4 kPa a 100 kPa. Criamos uma plataforma de alta taxa de transferência para o TFM, Particionando esses grandes substratos monolíticos espacialmente em poços bioquimicamente independentes, criando uma plataforma multipoços para a triagem de força de tração que é compatível com sistemas de vários poços existentes.
Neste manuscrito, utilizamos este sistema de força de tração multipoços para examinar a transição epitelial para mesenquimal (EMT); Nós induzem o EMT em pilhas de NMuMG expondo os a TGF-β, e para quantificar as mudanças biofísicas durante EMT. Nós medimos a contratilidade em função da concentração e da duração da exposição ao TGF-β. Nossos achados aqui demonstram a utilidade da TFM paralelizada no contexto da doença Biofísica.
Introduction
A contratilidade do acto-miosina é um elemento essencial da mecânica celular ativa, impactando os comportamentos celulares da motilidade e proliferação para a diferenciação das células-tronco. Nos tecidos, a contratilidade impulsiona a atividade da separação polar na embriogênese, à constrição das vias aéreas e à atividade cardíaca. Criticamente, para gerar tensão, as células devem primeiro aderir ao seu ambiente extracelular. Ao fazê-lo, essa contratilidade gera forças de tração em seus arredores. A microscopia da força da tração (TFM) emergiu em uma multidão de formulários como uma maneira de quantificar estas forças das pilhas diversas circunstâncias diferentes.
O campo da TFM tem visto uma amplitude excepcional de inovação e aplicação, e os resultados têm pavimentado o caminho para novas perspectivas na biologia, que incorporam mecânica e forças físicas. Começando com enrugamento de substratos de silicone1, pesquisadores têm aplicado várias técnicas para medir as forças de tração celular. Estas abordagens têm sido continuamente melhoradas e alcançaram agora um nível de resolução na ordem de vários mícrons2. No entanto, surgiu um problema principal, que é a dificuldade em criar substratos de moduli adequadamente baixo usando os silicones disponíveis. Para contornar esse problema, a poliacrilamida foi adotada como um substituto devido à facilidade de criação de substratos na ordem de 1-20 kPa3. Recentemente implementamos silicones muito complacentes em TFM4, permitindo-nos fabricar a mesma gama de moduli como poliacrilamida, mas com as vantagens de silicone inerte e robusto.
As aproximações de TFM permitiram descobertas mechano-biológicas valiosas, entretanto, um lacuna persistente são sua complexidade, restringindo frequentemente seu uso aos investigadores nas disciplinas da engenharia ou das ciências físicas. Isto é devido em grande parte às calibrações detalhadas e cálculos desafiadores que são necessários para quantificar a contratilidade. Outro desafio significativo é que os métodos de TFM são em grande parte baixa taxa de transferência e, portanto, mal adaptados para estudar muitas condições diferentes ou populações simultaneamente5. Isso tem apresentado um gargalo, que tem dificultado a transferência de TFM a partir de um especialista em Biofísica configuração em aplicações biológicas e farmacológicas mais amplas.
Desenvolvemos recentemente uma placa TFM de formato multi-bem, que permite aos pesquisadores paralelizar suas medições de TFM para uma quantificação mais rápida das métricas de contratilidade, explorando o impacto de diferentes compostos e também usando menos reagentes4 . Esta metodologia tem ampla utilidade em diversos estudos de mecanobiologia, desde a avaliação dos efeitos de compostos na atividade celular, até a quantificação das alterações contrátil da diferenciação ou da doença.
Uma área de pesquisa biomédica que beneficiará grandemente da TFM é o estudo de como as pistas físicas impactam os fenótipos malignos das células cancerosas. A metástase, responsável para 90% de mortes Cancer-relacionadas, é caracterizada por pilhas cancerosas que saem de seu local original do tumor e que colonizar um local secundário. Para que as células migrem através do tecido e passem dentro e fora do sistema vascular, eles devem mudar radicalmente suas formas para espremer através dessas barreiras físicas, gerando forças substanciais para puxar seu caminho ao longo da matriz extracelular ou mover-se entre outros Células. Essas forças são transmitidas ao substrato por meio de interações de adesão focal2,3, podendo ser quantificadas usando TFM. Embora os cânceres sejam bioquimicamente excepcionalmente diversificados, com um repertório em expansão de mutações conhecidas e alterações protéicas, algumas mudanças físicas comuns foram observadas; em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de mama, próstata e pulmão, as células metastáticas têm demonstrado exercer 2-3 vezes as forças de tração das células não metastáticas6,7,8. Estes resultados sugerem que pode haver uma forte correlação entre a progressão metastática e as forças de tração exercidas pelas células; Entretanto, as mudanças tempo-dependentes detalhadas na contractilidade são difíceis de examinar.
A transição epitelial-mesenquimais (EMT) é um processo pelo qual as células reduzem aderências-e aderência da célula celular mediada pela junção apertada, tornando-se mais migratórias e invasivas. Além de funções fisiológicas que incluem cicatrização de feridas e processos de desenvolvimento, o EMT também é um processo explorado durante a metástase, tornando-se um sistema de modelo útil para estudar esse processo. Usando TGF-β, podemos induzir o EMT em células epiteliais mamárias murinas (NMuMG)9 para quantificar diretamente as alterações físicas durante essa transformação, e caracterizar o tempo e os efeitos dose-dependentes de TGF-β em EMT e contratilidade celular. Neste artigo, nós Demonstramos a utilidade desta aproximação medindo as mudanças na contractilidade durante um EMT induzido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para o sucesso deste método, é crítico ter uma amostra uniformemente revestida com uma espessura constante de aproximadamente 100 μm. O módulo deve ser cuidadosamente escolhido para examinar o significado físico do sistema biológico de interesse. Ao fabricar uma camada superior, a concentração das partículas fluorescentes de autenticação deve ser otimizada para uma análise precisa do esforço de deslocamento e tração. A análise de células isoladas únicas requer uma camada fiduciária mais densa do que a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Tom Kodger, Michael Landry, e Christopher J. Barrett para obter assistência com a síntese do cordão. A.J.E. reconhece as bolsas do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Instituto canadense de pesquisa em saúde conceder n º 143327, sociedade canadense de câncer conceder n º 703930, e Fundação Canadense para a inovação #32749 do projeto. R. Denilson reconhece os institutos nacionais de saúde não conceder. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. foi apoiado por Fonds de Recherche Santé Québec, e Fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Os autores agradecem a Johanan Idicula pela ajuda com o vídeo e o manuscrito e Zixin ele para obter ajuda na preparação do vídeo.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
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