Summary
Vi presenterer en høy gjennomstrømming trekkraft kraft analysen fabrikkert med silikon gummi (PDMS). Denne romanen analysen er egnet for å studere fysiske endringer i celle contractility under ulike biologiske og biomedisinsk prosesser og sykdommer. Vi viser denne metoden er verktøyet ved å måle en TGF-β avhengig økning i contractility under epitel-til-mesenchymal overgangen.
Abstract
Cellular contractility er vesentlige inne forskjellige aspektene av Biology, kjørende prosesser det omfang fra motilitet og inndelingen, å tissue sammentrekning og mekanisk stabilitet, og representerer en kjernen Component av mange--Cellular dyr livet. I tilhenger celler, acto-myosin sammentrekning er sett i trekkraft krefter som cellene øve på underlaget. Feilregulering av cellulære contractility vises i et mylder av patologi, noe som gjør contractility et lovende mål i ulike diagnostiske tilnærminger ved hjelp av biofysikk som en beregning. Videre kan romanen terapeutiske strategier være basert på å korrigere den åpenbare funksjonsfeil av celle contractility. Disse programmene krever imidlertid direkte kvantifisering av disse kreftene.
Vi har utviklet silikon elastomer-baserte traction Force mikroskopi (TFM) i en parallelized multi-brønn format. Vår bruk av en silikon gummi, spesielt Polydimethylsiloxan (PDMS), snarere enn de vanligvis sysselsatte hydrogel polyakrylamid (PAA) gjør oss i stand til å gjøre robuste og inert underlag med ubestemt hylle-liv krever ingen spesialiserte lagringsforhold. I motsetning til Pillar-PDMS-baserte tilnærminger som har en modul i GPa-serien, er PDMS som brukes her, svært kompatibel, med alt fra ca. 0,4 kPa til 100 kPa. Vi skaper en høy gjennomstrømming plattform for TFM ved å partisjonere disse store monolittisk underlag romlig inn biokjemisk uavhengige brønner, og skaper en multi-brønn plattform for traction Force screening som er kompatibel med eksisterende multi-brønn systemer.
I dette manuskriptet bruker vi denne multi-brønn traction Force system for å undersøke epitel til mesenchymal Transition (EMT); Vi induserer EMT i NMuMG celler ved å utsette dem for TGF-β, og å kvantifisere Biofysiske endringer under EMT. Vi måler contractility som en funksjon av konsentrasjon og varighet av TGF-β eksponering. Våre funn her demonstrere nytten av parallelized TFM i sammenheng med sykdom biofysikk.
Introduction
Acto-myosin contractility er et vesentlig element i aktiv celle mekanikk, påvirker celle atferd fra motilitet og spredning til stilk cellen differensiering. I vev, contractility stasjoner aktivitet fra Polar separasjon i embryogenesis, til luftveiene innsnevring og hjerte aktivitet. Kritisk, for å generere spenning, celler må først forholde seg til deres ekstracellulære miljø. Ved å gjøre dette genererer denne contractility trekkraft krefter på sine omgivelser. Traction Force mikroskopi (TFM) har dukket opp i en rekke former som en måte å kvantifisere disse kreftene fra ulike celler under ulike forhold.
Feltet TFM har sett en eksepsjonell bredde av innovasjon og anvendelse, og resultatene har banet vei for nye perspektiver i biologi, som innlemme mekanikk og fysiske krefter. Fra og med rynker silikon underlag1, har forskere brukt ulike teknikker for å måle celle trekkraft krefter. Disse tilnærmingene har blitt kontinuerlig forbedret og har nå nådd et nivå av oppløsning på rekkefølgen av flere mikron2. Men et hovedproblem har oppstått, som er vanskeligheten med å skape underlag av passende lave moduli ved hjelp av de tilgjengelige silikoner. For å omgå dette problemet ble polyakrylamid vedtatt som en erstatning på grunn av den enkle opprettingen av underlag på rekkefølgen av 1-20 kPa3. Vi har nylig gjennomført svært kompatibel silikoner i TFM4, slik at vi kan dikte det samme utvalget av moduli som polyakrylamid, men med fordelene med inert og robust silikon.
TFM tilnærminger har aktivert verdifulle mechano-biologiske funn, men en vedvarende brist er deres kompleksitet, ofte begrenser deres bruk til forskere i ingeniørfag eller fysiske vitenskaper disipliner. Dette skyldes i stor grad til detaljerte kalibreringer og utfordrende beregninger som er nødvendig for å kvantifisere contractility. En annen viktig utfordring er at TFM metoder er i stor grad lav gjennomstrømming og derfor dårlig egnet til å studere mange ulike forhold eller populasjoner samtidig5. Dette har presentert en flaskehals, som har hemmet overføring av TFM fra en spesialist biofysikk innstilling i bredere biologiske og farmakologiske anvendelser.
Vi har nylig utviklet en multi-brønn format TFM plate, som lar forskere å parallelize sine TFM målinger for raskere kvantifisering av contractility beregninger, mens du utforsker virkningen av ulike forbindelser og også bruke mindre reagenser4 . Denne metodikken har bred nytte i ulike mechanobiology studier, fra evaluere effekten av forbindelser på mobilnettet aktivitet, for å kvantifisere den kontraktile endringer i differensiering eller sykdom.
Ett område av biomedisinsk forskning som vil ha stor nytte av TFM er studiet av hvordan fysiske signaler påvirke ondartet fenotyper av kreftceller. Metastasering, ansvarlig for 90% av kreft-relaterte dødsfall, er preget av kreftceller forlate sin opprinnelige tumor stedet og kolonisere et sekundært nettsted. For celler til å migrere gjennom vev og passere inn og ut av det vaskulære systemet, må de radikalt endre sine former for å presse gjennom disse fysiske barrierene samtidig generere betydelige krefter til å trekke seg langs ekstracellulære matrise eller flytte mellom andre Celler. Disse kreftene er overført til underlaget gjennom fokal vedheft interaksjoner2,3, og kan kvantifisert ved hjelp TFM. Mens kreft er biokjemisk eksepsjonelt mangfoldig, med et voksende repertoar av kjente mutasjoner og protein endringer, noen vanlige fysiske endringer er observert; i en rekke kreftformer, inkludert bryst, prostata og lungekreft, har metastatisk celler vist å utøve 2-3 ganger trekkraft kreftene til ikke-metastatisk celler6,7,8. Disse resultatene tyder på at det kan være en sterk korrelasjon mellom metastatisk progresjon og trekkraft krefter som utøves av celler; Det er imidlertid vanskelig å undersøke de detaljerte tidsavhengige endringene i contractility.
Den epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) er en prosess der cellene redusere adherens-og tett-krysset mediert celle-celle vedheft, blir mer trekk og invasiv. I tillegg til fysiologiske funksjoner som inkluderer sår healing og utviklingsmessige prosesser, EMT er også en prosess utnyttes under metastasering, noe som gjør det til en nyttig modell system for å studere denne prosessen. Ved hjelp av TGF-β, kan vi indusere EMT i murine melke epitelceller (NMuMG)9 til direkte kvantifisere de fysiske endringene i løpet av denne transformasjonen, og karakteriserer tid og dose-avhengige effekter av TGF-β på EMT og celle contractility. I denne artikkelen viser vi nytten av denne tilnærmingen ved å måle endringene i contractility under en indusert EMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: følgende protokoll vil lede forskere i fabrikere og bruke multi-godt TFM parabolen vist i figur 1.
1. utarbeidelse av PDMS silikon underlag
- Utarbeidelse av PDMS silikon gummiblanding basert på en sammensatt blanding av to kommersielt tilgjengelige kits.
- Legg del A og del B av PDMS Kit (f. eks, GEL-8100, se tabellen av materialer) i et 1:1 vekt forhold i 50 ml røret.
Merk: blandingen blandes på en Rotator med en hastighet som er langsom nok til at blandingen kan flyte frem og tilbake under revolusjonen for å sikre fullstendig miksing. - Tilsett nødvendig mengde herding agent for ønsket modul av underlaget.
Merk: mengden herding agent som skal legges til blandingen avhenger av ønsket modul av underlaget og kan vanligvis variere fra 0,1% til 1,8%. Se tabell 1 og Figur 3 for en guide til spesifikke tverrbinder konsentrasjoner og resulterende moduli. - Bland formuleringen på Rotator for 30-45 min; at rotasjonen er langsom nok til grundig miksing.
- Legg del A og del B av PDMS Kit (f. eks, GEL-8100, se tabellen av materialer) i et 1:1 vekt forhold i 50 ml røret.
- Nederste lag: belegg PDMS underlag på glass Slide
- Plasser spesialbygd Chuck illustrert i figur 2 på spin-elektrostatisk. Rengjør glasset med etanol eller isopropanol, og tørk av med en lofri klut. Plasser glass lysbildet i Chuck, og slå på vakuumet for å holde raset på plass.
- Påfør uherdet PDMS ca 1 cm fra kantene og arbeid i mot midten. Påfør nok (3-4 mL) PDMS å sikre at hele overflaten vil bli dekket.
Merk: for å sikre at PDMS er jevnt fordelt på overflaten av glasset, kan en pipette tips være nyttig å spre PDMS blandingen fra sentrum til kantene. - Spinn glasset med PDMS-blandingen på en spin-elektrostatisk med følgende protokoll.
- For å spre uherdet PDMS på lysbildet, akselerere ved 50 RPM/s fra 0 til 200 RPM; holde på 200 RPM for 1 min.
- For å oppnå en 100 μm tykt PDMS-lag, akselerere ved 50 RPM/s til 300 RPM og hold i 1 min ved 300 RPM. Forskjellige ønskede tykkelser enn 100 μm vil kreve spesifikke hastighets verdier.
- For å fjerne, avta ved 50 RPM/s til 0 RPM. Deaktiver vakuum og fjerne belagt lysbilde, ta vare ikke å røre den belagte overflaten.
Merk: det er viktig å inkludere akselerasjon og retardasjon trinn for å sikre en jevn kontinuerlig overflate.
FORSIKTIG: for å sikre at prøven ikke flyr av Chuck, bør skreddersydd holderen brukes til å holde raset, og ikke stole bare på vakuum og den eksisterende flat Chuck. Detaljene og spesifikasjonene til denne innehaveren er gitt i figur 2.
- Plasser den spin-belagte prøven i ovnen på produsentens anbefalte temperatur (100 ° c) for 2 timer.
Merk: overflaten på ovnen der prøven er plassert bør være solid (dvs. ikke et wire rack) og jevn overflate for å sikre jevn oppvarming og tykkelse av prøven. En keramisk eller stålplate gjør en ideell overflate.
- Topp perle lag
- Legg perle løsning i riktig forhold til den resterende PDMS blanding.
Merk: Dette forholdet avhenger av konsentrasjonen av aksjen perlen løsningen og ønsket perle tetthet på prøven. Typiske endelige verdier er 9,2 x 1011 perler/ml og 0,05-0.2 perler/μm2, og et overskudd av perler er vanligvis å foretrekke fremfor et utilstrekkelig beløp. - Bland perle løsningen med uherdet PDMS. Dette kan oppnås ved å plassere røret på en Rotator i ca 30 min, virvlingen for 1-2 min, eller sonikering i 30 min. Disse metodene kan kombineres.
Merk: i søknaden vår, finner vi at sonikering er effektiv i å bryte perle aggregater, og rotasjon er effektiv i miksing. Syntetisert tillitsforhold perler kan samlet i lagring. Før bruk, kan de være resuspendert i Heksan og sonikert. Hvis det er betydelige store aggregater, kan man filtrere perle suspensjonen gjennom et sprøyte filter på 5 μm. Dette Filtreringstrinnet er valgfritt. Det bidrar til å belegge prøven med monodisperserte perler, men en betydelig brøkdel av perlene kan gå tapt i filteret. - Ta ut raset fra ovnen, la avkjøles til romtemperatur, og plasser den på spin-elektrostatisk.
- Tilsett 3-4 mL av perlen og uherdet PDMS-blandingen på overflaten av den belagte prøven.
Merk: blandingen med perler tilsettes er mindre tyktflytende på grunn av Heksan. Pass på at du ikke berører overflaten av underlaget, da det kan skade det allerede belagte PDMS-underlaget. I tillegg kan perle blandingen i utgangspunktet ikke fukte overflaten; ta vare på at blandingen ikke umiddelbart flyte av herdet PDMS overflaten. - Snurr prøven med følgende protokoll.
- For å spre perle og uherdet PDMS blanding, akselerere ved 100 RPM/s fra 0 til 500 RPM; holde på 500 RPM for 1 min.
- For å oppnå et tynt lag av perle-embedded PDMS (~ 1 μm), akselerere ved 200 RPM/s fra 500 til 5000 RPM; holde på 5000 RPM for 10 s.
- For å fjerne, avta ved 100 RPM/s til 0 RPM. Arbeidsudyktig tomrom og fjerne belagt skyve, tar bekymre ikke for å berøre det belagt overflate.
- Plasser den spin-belagte prøven i ovnen ved 100 ° c i 1 time.
Merk: temperaturer over 100 ° c eller varigheter lengre enn 1 time kan redusere perle fluorescens. Sørg for at ovnstemperaturen er satt til 100 ° c og ikke høyere. - Protokollen kan stanses midlertidig her. For å lagre prøven, dekk til overflaten for å unngå støv og lys eksponering. Pass på at ingenting berører overflaten. Prøven er hylle-stabil ved romtemperatur på ubestemt tid.
- Legg perle løsning i riktig forhold til den resterende PDMS blanding.
- Montering av platen
- Legg del A (base) og del B (herding agent, f. eks, Sylgard) av en PDMS elastomer Kit i en 10:1 vekt forhold i 50 mL røret.
- Bland blandingen på Rotator for 30-45 min.
Merk: for en tallerken, bland 5 mL base med 0,5 mL herding agent. Opp til 1 mL Heksan kan tilsettes for å redusere viskositet av blandingen. - Påfør blandingen til bunnen av skillet og spre blandingen.
Merk: skillelinjen skal plasseres opp-ned. - Legg underlaget på skillelinjen opp-ned.
- Plasser prøven opp-ned i ovnen ved 65 ° c i 2 timer.
- Ta ut prøver fra ovnen og rengjør bunnen av glasset med 70% etanol eller isopropanol for å fjerne eventuelle PDMS rester.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. For å lagre prøven, Plasser et lokk på underlaget og pakk enheten i aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lyset. Prøven er hylle-stabil ved romtemperatur på ubestemt tid. Skillet benyttet i denne metoden er i en 96-brønn format; Imidlertid kan forskerne ansette andre formater (384-brønn, 2-Vel, 4-Vel, 8-brønn, etc.) avhengig av ønsket eksperiment oppsett og tilgjengelighet av å dele strukturer. Noen ytterligere optimalisering kan være nødvendig.
2. overflate funksjonalisering
- Løs opp 80 μL av en Sulfo-SANPAH alikvot i 40 mL 0,1 M HEPES buffer (pH 7-9).
Merk: Forbered Sulfo-SANPAH alikvoter ved å oppløse 100 mg Sulfo-SANPAH pulver i 2 mL sterilt dimethyl sulfoxide (DMSO). Forbered 0,1 M HEPES buffer ved å fortynne 50 mL HEPES i 450 mL sterilt deionisert vann og Filtrer gjennom et filter med en 0,22 μm. - Tilsett 200 μL av fortynnet Sulfo-SANPAH-løsning på hver brønn av 96-brønn platen.
- Utsett platen for UV-lys (300-460nm) i passende avstand og varighet.
Merk: etter UV-stråling bør fargen på oppløsningen være mørkere. Avstand for UV-eksponering og varighet avhenger av UV-lampens strøm. I vår søknad, utsetter vi for 10-15 min i en avstand på 5 cm. - Fjern Sulfo-SANPAH-løsningen fra brønnene og tilsett 200 μL av 5 μg/mL fibronektin-oppløsning til hver brønn.
Merk: forsker-spesifisert protein kan brukes for overflatebelegg. Noen brukte proteiner er kollagen, fibronektin og laminin. Vi har funnet Sulfo-SANPAH å være den mest effektive metoden, og plasma rengjøring mens noen ganger sysselsetter i PDMS frarådes da det skaper en silisium karbondioksid lag og synlig skader overflaten. - Ruge platen ved 4 ° c over natten.
Merk: ulike inkubasjons metoder kan brukes avhengig av proteinet som brukes til belegg. - Fjern fibronektin løsningen og vask hver brønn med fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger.
- Sett et lokk på prøven.
- Tilsett 200 μL av PBS i hver brønn.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Fibronektin-belagte prøver kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 uker.
3. UV sterilisering
- Sterilisere prøven under UV-lys i et biologisk sikkerhetskabinett i 30 minutter.
Merk: lengre UV eksponeringstider kan ha en negativ innvirkning på perle fluorescens. Alle påfølgende trinn må utføres under sterile forhold.
4. cellekultur
- Fjern PBS fra hver brønn og tilsett 200 μL av celler suspendert i kultur Media til hver brønn.
- Plate cellene i ønsket celle tetthet. Celle tetthet avhenger av det ønskede eksperimentet. For enkelt celle studier bør celler være minst 50 μm fra hverandre og celler nær kantene av bildevinduet bør ikke være inkludert i TFM-målingen. For monolag celler bør bildevinduet ha visningsfeltet dekket med et confluent lag med celler.
- Forbered den komplette vekst kulturen Media for NMuMG celler ved å supplere DMEM med 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL insulin, 1% penicillin-Streptomycin, 1 mM L-glutamin, og 0,5 μg/mL amfotericin B.
- Forbered insulin bestanden ved rekonstituering av i surgjort vann (2,5 mL av isbre eddiksyre i 130 mL deionisert vann) til en konsentrasjon på 10 mg/mL. Oppbevar lager løsningen ved 4 ° c. Vent til oppløsningen er klar, og deretter filtrere gjennom et 0,22 μm pore filter.
- TGF-β tillegg
- For å forberede av TGF-β lager, oppløse 2 μg av TGF-β i 100 μL av 10 mM sitronsyre (pH 3,0) og filter sterilisere med 0,22 μm porene. Vortex røret og alikvot inn i ønsket volum. Oppbevar alikvoter ved-80 ° c.
- Tilsett 1,5 μL av TGF-β lagerløsning til 10 mL av den komplette cellen kultur Media til å utgjøre cellen kultur Media med den endelige TGF-β konsentrasjon av 3 ng/mL.
Merk: for å lage 10 mM pH 3,0 sitronsyre, fortynne syren i vann og justere pH til 3,0 ved å legge HCl.
5. innhenting av data
- For hver posisjon, erverve minst ett bilde av tillitsforhold partikler og celler. Fokuser på perle laget.
Merk: pixel størrelse bør optimaliseres basert på størrelsen på tillitsforhold partikler og bildebehandling metoden som brukes. I dette programmet, forfatterne bruker en 10x 0,4 NA mål, og bilder er ervervet med 1024 x 1024 oppløsning, med 455 NM/pixel. Generelt er det nyttig å beholde en oppløsning på minst ca. 1-5 piksler per perle; her, perler er polydisperse og har en individuell størrelse på 300-500 NM. Det er viktig at fluorescerende tillitsforhold perler være i fokus for bilder som skal brukes til TFM beregninger. Fokus og bildekvalitet av perlene bør prioriteres over Imaging cellene selv. Det bør ikke være noen kryss-snakk mellom ulike kanaler, spesielt noen fluorescens ikke fra tillitsforhold perler som vises i Imaging Spectra av perlene. - Når alle stillingene av interesse har blitt registrert, legger avløsning løsning på hver brønn for å erverve Force-Free referanse bilder av tillitsforhold partikler.
- For å forberede celle avløsning løsning, bland en vandig løsning som inneholder 2% TritonX-100, 50 mM natrium Natriumazid, og 500 mM kalium.
Merk: ovennevnte er gitt som et eksempel på en effektiv avløsning løsning. Ulike avløsning løsninger på forskere skjønn kan brukes til å løsne cellene av underlaget overflaten.
- For å forberede celle avløsning løsning, bland en vandig løsning som inneholder 2% TritonX-100, 50 mM natrium Natriumazid, og 500 mM kalium.
6. bildeanalyse
- Utfør passende bildeanalyse etter ønske.
Merk: analyseprogramvare ble utviklet internt. Bildeanalyse kan gjøres med skreddersydd programvare eller programvare tilgjengelig på nettet.
7. perle syntese
Merk: følgende protokoll er basert på syntese metoden beskrevet av Klein et al.10.
- Under en avtrekks hette, Forbered de tre-hals kolbe med en vannkjølt reflux kondensator.
FORSIKTIG: Sett opp en syntese i en godt ventilert kjemisk avtrekks hette. - Tilsett 0,5 mL PDMS stabilisator og fluoroforen til flasken.
- Utstyre en hals med en gummi septum med nitrogen inntaks nål og en stikkontakt nål og utstyre den andre halsen med en gummi septum for å legge reagens med en sprøyte.
- Tilsett 100 mL vannfri Heksan i 250 mL til flasken og tilsett en liten magnetisk røre bar.
- Plasser flasken i mineralolje badet ved 75 ° c og Tøm den med nitrogen gass i 1 time.
- Tilsett 6 mL methylmethacrylate på en 25 mL rund bunn kolbe.
- Tilsett 0,100 g av 2, 2 '-azobisisobutyronitrile (SHTS) til den runde bunnen kolbe og PURGE blandingen med nitrogen gass for 1 t.
Merk: Skyll methylamethacrylate gjennom ferdigpakkede kolonne for å fjerne hemmere før bruk. Legg methylamethacrylate og SHTS blandingen til tre-hals kolbe. - Løsningen blir i utgangspunktet overskyet og blir melkeaktig. La reaksjonen gå i 3 timer etter at oppløsningen blir uklar.
- Etter 3 timer, plasser flasken i et isvannbad.
- Vakuum-Filtrer løsningen med grov filter papir.
- Sentrifuger Filtrer og re-suspendere partiklene i Heksan.
Merk: volumet på Heksan som skal legges til, avhenger av den ønskede konsentrasjonen av perle løsningen. Sonikering forenkler re-dispersjon av perle partikler i Heksan løsning. Perler produsert av forfatterne har polydisperse diameter på ca 300-500nm. På grunn av bruk av kryss-korrelasjon mønster sporing for å bestemme forskyvninger, monodisperse perler er ikke nødvendig.
8. Reologi måle protokoll
Merk: Reologi er ikke nødvendig for hver forsker eller eksperiment, men er nødvendig for å kvantifisere moduli for nye formuleringer av PDMS. I denne protokollen benytter vi en skjær rheometer for å måle effekten av tverrbinder, hyppighet og belastning på moduli av PDMS-prøver. Avhengig av tilgjengelige verktøy og ekspertise kan moduli også måles med mange andre mekaniske analyse tilnærminger. I tillegg kan forskere som bruker denne protokollen velge å bruke våre publiserte moduli presentert i tabell 1, Figur 3 og Figur 4.
- Bruk en rheometer med en 25 mm diameter parallell plate geometri. Annen geometri kan brukes.
- Initialiser systemet og Kalibrer enheten og målesystemet (parallell plate, d = 25 mm). Når du har målt null gapet, begynner du å laste inn PDMS-prøven.
- Så snart PDMS elastomer og Cross Linking agent har blitt blandet, Pipet blandingen på bunnen plate av rheometer.
- Flytt akselen ned til helt kontakt toppen av PDMS prøven.
- Nøye trimme lastet prøven overflødig fra bunnplaten.
- I en belastning feie test, gjelder økende belastninger for hver komposisjon med ulik Cross Linking tetthet for å sikre at polymer strukturen forblir i den lineære viskoelastiske regime under alle skjær mål.
Merk: belastnings verdier som er relevante for celle studier er vanligvis i området 0,1-10%. Vi har funnet PDMS å være lineær opp til ca 100% belastning. - Mål den dynamiske skjær lagring modul (G '), og tap modul (G ' ') av PDMS nettverket i en tid feie test med frekvens på 1 Hz og oscillasjon skjærbelastning på 0,5% ved 100 ° c.
- For å bestemme viscoelasticity og tidsavhengig heten til det endelige PDMS-nettverket, Påfør en frekvens feier test med frekvens som spenner 0,1-100 Hz og oscillasjon skjærbelastning på 0,5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før tillegg av TGF-β, en confluent monolag av celler har en Brostein som form og er tett pakket. Ved TGF-β behandling, celler blir mer langstrakt i morfologi, forstørre celleområdet og anskaffe en mer mesenchymal fenotype. Ved hjelp av multi-brønn enhet fabrikkert med myke PDMS elastomerer, de fysiske egenskapene til cellene i en total 17 forskjellige forhold ble studert. Cellene ble behandlet med fire forskjellige TGF-β konsentrasjoner (0,5, 1, 2 og 4 ng/mL) og fire forskjellige inkubasjons ganger (12, 24, 48, 96 h), og disse resultatene er oppsummert i figur 5. Cellene behandlet med TGF-β påføres større trekkraft påkjenninger og belastning energier enn cellene kultivert uten TGF-β. Celler inkubert med TGF-β for 96 h viste den største trekkraft påkjenninger og belastning energier. Cellene påføres større påkjenninger og belastning energier når behandlet med høyere konsentrasjon av TGF-β. Forskjellen i tractions og strekk energier var mer tydelige på lengre inkubasjons tider.
Overflaten av underlaget må være glatt og jevnt belagt med ligander, slik som fibronektin eller kollagen. Ripete overflate og/eller ikke-ensartet belegg av ligander kan føre til uriktig celle vedlegg, noe som resulterer i unøyaktig trekkraft måling. Figur 6 viser lokaliserte trekkraft påkjenninger på grunn av den ikke-uniform substrat overflaten.
Figur 1 : Oversikt over produksjon av flere brønn plater. (A) en spesial-cut glass slide er utgangspunktet. (B) glass raset er belagt med et tykt (~ 100 μm lag av PDMS). (C) et lag av tillitsforhold perler (vist i grønt) er så spin-belagt i en ~ 1 μm tykt lag på toppen av forrige lag. (D) multi-brønnen skillevegg er nøye plassert på toppen av tillitsforhold perle laget. (E) den komplette multi-Well plate er montert og klar til bruk eller lagring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Tilpasset Chuck for spin-elektrostatisk. For å hindre at det nederste glasset (der PDMS er belagt) fra å fly ut av standard spin-elektrostatisk Chuck, er en skreddersydd holder plassert på Chuck. (A) en skreddersydd holder for spin-elektrostatisk Chuck. (B) engineering tegning av holderen med alle dimensjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Substrat stivhet med skiftende tverrbinder konsentrasjon (WT%). PDMS-blandinger fremstilles som beskrevet, med den ekstra tverrbinder prosenten som øker den elastiske modulen til en maks på 100 kPa ved 1,8 vektprosent (WT%) tverrbinder. Som en rettesnor passer modulen som en funksjon av tverrbinder lineært, som kan brukes av forskere til å formulere sin egen blanding på en bestemt ønsket modul innenfor dette området. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Reologi av PDMS elastomer inneholdende 0, 0,15, 0,36 og 1 WT% av krysskobling midler ved en temperatur på 100 ° c. Trekant symboler angir taps modul (G ' ') og firkantede symboler indikerer lagrings modul (G '). (A) oscillasjon tid feie på frekvensen av 1 Hz og skjærbelastning på 0,5% under gelation. (B) oscillasjon frekvens SVEIP av PDMS nettverk ved skjærbelastning på 0,5%. (C) strekk SVEIP av PDMS nettverk med frekvens på 1 Hz. Alle datapunkter ble anskaffet i tre eksemplarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representative resultater utnytte trekkraft stress enhet med multi-brønn format. Monolag av celler i ulike forhold var kultivert i en multi-brønn enhet for å måle contractility og belastning energi. (A) graf av trekkraft påkjenninger med økende TGF-β inkubasjonstid for ulike TGF-β konsentrasjoner. Traction understreker økt med økende TGF-β konsentrasjoner og inkubasjonstid. Alle data er statistisk signifikant med hensyn til kontroll (dvs. ingen TGF-β) unntatt følgende: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 48 h-1 ng. (B) graf av belastning energi med økende TGF-β inkubasjonstid for ulike TGF-β konsentrasjoner. Belastning energier økte med økende TGF-β konsentrasjoner og inkubasjonstid. Utvalgsstørrelsene varierer fra n = 7 til n = 15. Alle data er statistisk signifikant med hensyn til kontroll (dvs. ingen TGF-β) unntatt følgende: 12 h-0,5 ng, 12 h-1 ng, 24 h-0,5 ng, 24 h-1 ng, 48 h-1 ng. Statistisk betydning ble bestemt ved hjelp av Kruskal Wallis-testen, som ikke forutsetter en normalfordeling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Representative resultater fra en sub-optimal (a, B) og et tilfredsstillende (C, D) eksperiment. (A) refleksjon bilde av underlaget overflaten. Uønskede forurensninger, som kan inkludere støv eller fibre, eller materielle defekter som riper er tilstede på underlaget overflaten. B Stress kart over celle contractility: på grunn av den ikke-uniform overflate, uregelmessig og unøyaktig trekkraft påkjenninger er observert rundt objektene. C Refleksjon bilde av underlaget overflaten. Ingen åpenbare forurensninger er synlige. D Stress kart over celle contractility: ingen gjenstand avbrudd er synlige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tverrbinder konsentrasjon (WT%) | G ' (PA) | Standardavvik | E (kPa) | Standardavvik |
| 0 | 0,135 | 0,014 | 0,405 | 0,043 |
| 0,15 | 1 | 0,1 | 3 | 0,35 |
| 0,36 | 4,027 | 0,245 | 12,081 | 0,73 |
| 0,75 | 16,01 | 0,49 | 48,03 | 1,2 |
| 1 | 18,44 | 0,989 | 55,32 | 1,94 |
| 1,5 | 27,638 | 0,93 | 82,91 | 1,64 |
| 1,8 | 33,986 | 0,88 | 101,94 | 1,088 |
| 2 | 33,36 | 0,67 | 100,08 | 1,1 |
Tabell 1: Substrat stivhet med skiftende tverrbinder konsentrasjon (WT%). Ved å endre ytterligere tverrbinder konsentrasjoner, PDMS underlag av den ønskede Youngs moduli er fabrikkert. PDMS skjær moduli ble målt med en rheometer og Youngs moduli ble bestemt. For hvert datapunkt ble 3 uavhengige forberedelser gjort og standardavviket er gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For suksessen med denne metoden, er det avgjørende å ha en jevnt belagt prøve med en konstant tykkelse på ca 100 μm. Modulen bør være nøye utvalgt for å undersøke den fysiske betydningen av biologisk system av interesse. Når fabrikere et topplag, konsentrasjonen av fiducial fluorescerende partikler bør optimaliseres for nøyaktig analyse av forskyvning og trekkraft stress. Analysere isolerte enkeltceller krever en tettere tillitsforhold lag enn å måle confluent monolagere. I tillegg bør overflaten av underlaget har stabilt og ensartet belegg av vedheft molekyler som kollagen, fibronektin, og laminin for å sikre riktig feste av cellene til underlaget overflaten. Spesiell forsiktighet må utvises ved festing av multi-brønn skillelinjen; Det bør plasseres uten å skli for å hindre tetting PDMS lim fra å bli smurt på kulturen overflaten, og den ytre kanten må være nøye på linje med glass dimensjoner for å hindre eventuelle lekkasjer på grensen brønner.
For å hindre at brønner blir lekk, en tilstrekkelig mengde PDMS lim må påføres på godt skillelinje å holde den på plass. Men bruk av store mengder vil dekke celle kulturen overflaten.
Tilstrekkelig volum av PDMS må legges til under spin-coating prosedyren. Når herding, ovnen og stativer må være nivå. Utilstrekkelig PDMS eller en utjevnet ovn kan føre til ujevn PDMS tykkelse.
Perle tetthet må optimaliseres for riktig analyse. Når perle tettheten ikke er tilstrekkelig, konsentrasjon av perlene i tillitsforhold PDMS blanding må økes. I tillegg må en tilstrekkelig mengde av blandingen som skal tilsettes for spin belegg. For å sikre riktig fluorescerende signaler av tillitsforhold perle partikler, bør herding tilstand overvåkes nøye. Lengre tider og høyere temperaturer enn de som er angitt i denne protokollen kan forringe fluorescens. Uriktig protein belegg på overflaten av prøven kan føre til dårlig celle vedheft. For å hindre dette må overflaten rengjøres og utløpet av reagenser som Sulfo-SANPAH og ligander må sjekkes. UV-eksponering tid og styrke bør optimaliseres. Immunofluorescence eller annen fluorescerende protein konstruksjon kan testes for å sikre ensartet ligand belegg.
Enheten fabrikkert med denne metoden og sett av PDMS formuleringer gjelder bare for underlag med Youngs moduli fra 0,4 kPa til 100 kPa. Andre moduli kan være mulig ved hjelp av alternative formuleringer, men gjeldende område spenner over et stort sett med fysiologisk relevante verdier. Selv om denne metoden er spesielt for multi-godt fabrikasjon, kan det også brukes til å forberede individuelle lysbilder eller annen lysbilde geometri, og i disse tilfellene videre bruker feilsøking kan være nødvendig. I denne utførelsesform er en relativt tykk (1 mm) glass Slide ansatt, utelukker felles høy numerisk blenderåpning (NA) mål på en invertert mikroskop. Mens det er teknisk mulig å konstruere disse multi-Well TFM retter med tynnere glass, kan skjørhet av disse i prosessering og montering resultere i en høy grad av brudd, og kan kjøre i strid med høyere gjennomstrømming tilnærming. Videre kan overflatebelegget undersøkes videre for større anvendelser av anordningen.
Bruk av et fler brønn format, eksperimenter med høy gjennomstrømming er mulig. Multi-brønn format gjort oss i stand til å undersøke de fysiske endringene av NMuMG celler under EMT med TGF-β behandling med kombinasjoner av ulike konsentrasjoner og ulike inkubasjons ganger i en enkelt tallerken. Fremstilling av trekkraft stress enheter med hydrogeler som polyakrylamid gel har flere begrensninger. Med den dominerende ingrediensen er vann, hydrogeler er følsomme for salt konsentrasjoner (OSMOLARITETSSYSTEM), temperatur, fuktighet, og pH endringer. Endringer i noen av disse egenskapene kan føre til endring i mekaniske egenskaper av materialet, som krever ekstra forsiktighet ved bruk av prøver og tolke resultater. Videre har vann, hydrogeler er mer utsatt for infeksjoner, krever ekstra forsiktighet. I motsetning til vannbasert hydrogeler, silikon-baserte PDMS er stabil og inert. Når fabrikkert, kan det lagres ved romtemperatur i det uendelige uten å kreve noen spesielle håndtering eller lagring forhold.
Den ugjennomtrengelig natur PDMS tillater oss å dikte opp en monolittisk substrat, slik at alle brønnene er virkelig identiske i substrat tykkelse og sammensetning, samtidig som unike biokjemi skal brukes i Media, eller ulike celler som skal benyttes i hver Godt. En hydrogel overflate gjør det mulig for diffusive faktorer å trenge gjennom og reise gjennom den, nødvendiggjør å legge hydrogel til brønner som ellers er partisjonert for å hindre krysskontaminering.
Denne metoden gjør det mulig for forskere å studere celle contractility, en grunnleggende og allestedsnærværende aspekt av cellebiologi, i en høy gjennomstrømming måte, slik at mer effektiv og reproduserbar datainnsamling. Dette bidrar til å oversette traction Force mikroskopi i kontraktile Force screening, slik at forskerne å virkelig bruke contractility som en beregning for celle aktivitet, eller effekten av en sammensatt. Som en metodikk, har dette brede anvendelser på tvers av Biofysiske og biomedisinsk vitenskap, fra å forstå fysikken i cellene, til karakteriserer og testing av farmasøytiske forbindelser mot standardiserte celletyper, eller kanskje høyt spesialiserte individuelle celler for personlig medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AJE og RK har interesse for Live Cell Technologies, et selskap som fabrikerer materialer som er beskrevet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Tom Kodger, Michael Landry, og Christopher J. Barrett for hjelp med perle syntese. A.J.E. erkjenner Natural Sciences og engineering Research Council tilskudd RGPIN/05843-2014 og EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research Grant no. 143327, kanadiske Cancer Society gi no. 703930, og Canadian Foundation for Innovation Prosjekt #32749. R. Krishnan erkjenner National Institutes of Health Grant no. R21HL123522 og R01HL136209. H.Y. ble støttet av fonds de Recherche santé Québec, og fonds de Recherche Nature et Technologies Québec. Forfatterne takker Johanan Idicula for hjelp med video og manuskript og Zixin han for å få hjelp til å forberede videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
