PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.
Summary
우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.
Abstract
세포 수축은 생물학의 다양한 측면에서 필수적이며, 운동성과 분열에서 부터 조직 수축 및 기계적 안정성에 이르기까지 다양한 과정을 유도하며 다세포 동물 생명의 핵심 요소를 나타냅니다. 부착 된 세포에서 acto-myosin 수축은 세포가 기판에 발휘하는 견인력에서 보입니다. 세포 수축의 dysregulation는 무수한 병리학에서 나타나며, 수축은 생물 물리학을 지표로 사용하는 다양한 진단 접근법에서 유망한 표적으로 만듭니다. 더욱이, 새로운 치료 전략은 세포 수축의 명백한 오작동을 교정에 기초할 수 있다. 그러나 이러한 응용 프로그램에는 이러한 힘의 직접 정량화가 필요합니다.
당사는 실리콘 엘라스토머 기반 견인력 현미경(TFM)을 병렬화된 다중 웰 형식으로 개발했습니다. 실리콘 고무, 특히 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 일반적으로 사용되는 하이드로겔 폴리아크릴아미드(PAA)보다 특수 한 보관 조건이 필요하지 않은 무기한 유통 기한으로 견고하고 불활성 기판을 만들 수 있습니다. GPa 범위에 계수가 있는 기둥-PDMS 기반 접근법과 달리 여기에서 사용되는 PDMS는 약 0.4 kPa에서 100kPa에 이르는 매우 규정을 준수합니다. 우리는 이러한 대형 모놀리식 기판을 생화학적으로 독립적인 웰로 공간적으로 분할하여 TFM용 고처리량 플랫폼을 만들고, 기존 멀티웰 시스템과 호환되는 견인력 스크리닝을 위한 멀티 웰 플랫폼을 만들었습니다.
이 원고에서는 이 다중 웰 견인력 시스템을 사용하여 중형 전이(EMT)에 대한 상피를 검사합니다. 우리는 TGF-β에 노출시킴으로써 NMuMG 세포에서 EMT를 유도하고 EMT 동안 생물물리학적 변화를 정량화합니다. 우리는 TGF-β 노출의 농도 및 지속 시간의 함수로서 수축성을 측정합니다. 여기에서 우리의 사실 인정은 질병 생물물리학의 맥락에서 병렬화된 TFM의 유용성을 보여줍니다.
Introduction
Acto-myosin 수축은 활성 세포 역학의 필수 요소, 줄기 세포 분화운동성 및 증식에서 세포 행동에 영향을 미치는. 조직에서 수축성은 배아 발생의 극성 분리에서 기도 수축 및 심장 활동으로 의 활동을 유도합니다. 비판적으로, 긴장을 생성하기 위하여는, 세포는 첫째로 그들의 세포외 환경에 부착해야 합니다. 이 과정에서 이 수축은 주변 환경에 견인력을 생성합니다. 견인력 현미경 검사법 (TFM)은 다른 조건하에서 다양한 세포에서 이 힘을 정량화하는 쪽으로 양식의 다수에서 나타났습니다.
TFM 분야는 혁신과 응용의 뛰어난 폭을 보았다, 그 결과는 역학과 물리적 힘을 통합 생물학의 새로운 관점에 대한 길을 열었습니다. 주름 실리콘 기판 1을시작으로 연구자들은 세포 견인력을 측정하기 위해 다양한 기술을 적용했습니다. 이러한 접근법은 지속적으로 개선되었으며 이제 몇 미크론2의순서로 해상도 수준에 도달했습니다. 그러나, 한 가지 주요 문제점이 대두되고 있는데, 이는 사용 가능한 실리콘을 이용하여 적당히 낮은 변계의 기판을 만드는 데 어려움이 있다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 폴리아크릴아미드는 1-20 kPa 3의 순서로 기판을 쉽게생성하기 때문에 대체품으로 채택되었다. 우리는 최근에 TFM 4에서매우 준수 실리콘을 구현하여 폴리 아크릴 아미드와 동일한 범위의 모듈을 제작 할 수 있지만 불활성 및 견고한 실리콘의 장점을 가지고 있습니다.
TFM 접근은 귀중한 메카노 생물학 발견을 가능하게 했습니다, 그러나, 지속적인 결점은 그들의 복잡성, 수시로 공학 또는 물리 과학 분야의 연구원에게 그들의 사용을 제한합니다. 이는 계약을 정량화하는 데 필요한 세부 교정 및 까다로운 계산에 큰 부분을 차지합니다. 또 다른 중요한 과제는 TFM 방법은 대체로 처리량이 낮기 때문에 많은 다른 조건 이나 인구를 동시에 연구하기에 적합하지 않다는것입니다 5. 이것은 병목 현상을 제시했습니다, 이는 광범위한 생물학 및 약리학 응용으로 전문가 생물 물리학 조정에서 TFM의 전송을 방해했습니다.
우리는 최근에 연구원이 다른 화합물의 충격을 탐구하고 또한 더 적은 시약을 사용하여, 수축메트릭의 빠른 정량화를 위해 그들의 TFM 측정을 병렬화하는 것을 허용하는 다중 웰 포맷 TFM 격판을 개발했습니다4 . 이 방법론은 세포 활동에 대한 화합물의 효과를 평가하는 것에서부터 분화 또는 질병의 수축 변화를 정량화하는 것까지 다양한 메카노생물학 연구에서 광범위한 유용성을 가지고 있습니다.
TFM에서 크게 유익할 생물 의학 연구의 한 지역은 물리적 인 단서가 암세포의 악성 표현형에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 연구입니다. 전이, 암 관련 죽음의 90%를 책임지는, 암 세포가 그들의 본래 종양 사이트를 떠나 이차 사이트를 식민지화하는 특징입니다. 세포가 조직을 통해 이동하고 혈관 시스템 밖으로 통과하는 경우, 그들은 근본적으로 세포 외 매트릭스를 따라 자신의 길을 당기거나 다른 사이에 이동하는 상당한 힘을 생성하는 동안 이러한 물리적 장벽을 통해 짜내 자신의 모양을 변경해야합니다 셀. 이러한 힘은 초점 접착 상호작용2,3을통해 기판으로 전달되고 TFM을 사용하여 정량화될 수 있다. 암은 생화학적으로 매우 다양하지만, 알려진 돌연변이와 단백질 변화의 레퍼토리가 확대되면서 몇 가지 일반적인 물리적 변화가 관찰되었습니다. 유방암, 전립선암 및 폐암을 포함한 다양한 암에서, 전이성 세포는 전이성 세포의 견인력의 2-3배를발휘하는 것으로 나타났다 6,7,8. 이러한 결과는 전이성 진행과 세포에 의해 가해지는 견인력 사이에 강한 상관관계가 있을 수 있음을 시사한다. 그러나, 계약에 있는 상세한 시간 의존적인 변경은 검토하기 어렵습니다.
상피-중간엽 전이(EMT)는 세포가 부착체 및 접합 접매 세포 접착을 감소시켜 더 많은 철새와 침습이 되는 과정입니다. 상처 치유 및 발달 과정을 포함하는 생리적 기능 외에도 EMT는 전이 중에 악용되는 프로세스이기 때문에이 과정을 연구하는 데 유용한 모델 시스템입니다. TGF-β를 사용하여, 우리는 뮤린 유방 상피 세포 (NMuMG)9에서 EMT를 유도하여 이러한 변형 동안 물리적 변화를 직접 정량화하고, EMT 및 세포 수축성에 대한 TGF-β의 시간 및 용량 의존적 효과를 특성화할 수 있다. 이 문서에서는 유도된 EMT 동안의 수축도 변화를 측정하여 이 접근법의 유용성을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 성공을 위해 약 100 μm의 일정한 두께의 균일하게 코팅된 샘플을 사용하는 것이 중요합니다. 계수는 관심있는 생물학적 시스템의 물리적 중요성을 검사하기 위해 신중하게 선택해야합니다. 최상위 층을 제작할 때, 변위 및 견인 응력의 정확한 분석을 위해 피소형 입자의 농도를 최적화해야 합니다. 단리된 단일 세포를 분석하려면 최대 단일 층을 측정하는 것보다 밀도가 높은 신탁 층이 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 톰 코저, 마이클 랜디, 크리스토퍼 제이 배럿에게 비드 합성에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. A.J.E.는 자연과학 및 공학 연구 위원회가 RGPIN/05843-2014 및 EQPEQ/472339-2015, 캐나다 보건 연구 기관 보조금 제143327호, 캐나다 암 학회 보조금 703930, 캐나다 혁신 재단을 승인합니다. 프로젝트 #32749. R. 크리슈난은 국립 보건원 보조금 없음을 인정합니다. R21HL123522 및 R01HL136209. H.Y.는 폰드 드 레체쉬 산테 퀘벡, 퐁 드 레쉐 네이처 에 테크놀로지스 퀘벡의 지원을 받았습니다. 저자는 비디오와 원고와 Zixin He가 비디오를 준비하는 데 도움을 준 요한난 이디쿨라에게 감사를 표합니다.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
References
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