[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة
Summary
ويقدم هذا البروتوكول كيفية العيش الصورة وتحليل الخلايا الإنشائية قمية تبادل لإطلاق النار من الأنواع النباتية المختلفة باستخدام الليزر الفحص المجهري [كنفوكل].
Abstract
وظائف قمية أرض (SAM) تبادل لإطلاق النار كخزان خلايا الجذعية مصانة وأنه يولد تقريبا جميع الأنسجة سطحي أثناء تطوير السماني. بنشاط ومورفولوجية سامز تحديد السمات الزراعية الهامة، مثل الهندسة المعمارية تبادل لإطلاق النار، وحجم وعدد من الأعضاء التناسلية، والأهم من ذلك، إنتاج الحبوب. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحليل مورفولوجية السطحية والبنية الخلوية الداخلية معيشة سامز من الأنواع المختلفة من خلال الليزر المسح مجهر [كنفوكل]. الإجراء بأكمله من إعداد نموذج للحصول على صور عالية الدقة (3D) ثلاثي الأبعاد يمكن أن ينجز في غضون قصيرة بقدر 20 دقيقة. نثبت أن هذا البروتوكول ذات كفاءة عالية لدراسة ليس فقط نورات سامز الأنواع النموذجية ولكن أيضا الخلايا الإنشائية الخضري من المحاصيل المختلفة، وتوفير أداة بسيطة لكنها قوية لدراسة تنظيم وتطوير الخلايا الإنشائية عبر الأنواع النباتية المختلفة.
Introduction
يحتوي على مجموعة خلايا الجذعية غير متمايزة أرض المصنع وتحافظ باستمرار بمصنّع الجهاز النمو والتنمية1. أثناء تطوير السماني، تستمد تقريبا جميع الأنسجة سطحي للنبات من أرض قمية تبادل لإطلاق النار (SAM). في المحاصيل، بالنشاط والحجم SAM وبه المشتقة من الخلايا الإنشائية الأزهار ترتبط محكم مع العديد من السمات الزراعية مثل الهندسة المعمارية في تبادل لإطلاق النار، وإنتاج الفاكهة، ومحصول البذور. على سبيل المثال، يسبب سام موسع في الطماطم، زيادة في تبادل لإطلاق النار والمتفرعة من نورات، وبالتالي النتائج في توليد إضافية الزهور والفواكه الأجهزة2. في الذرة، وزيادة في حجم سام يؤدي إلى عدد أكبر من البذور والعائد الإجمالي3،4. وفي فول الصويا، عدم أرض يرتبط أيضا ارتباطاً وثيقا ببنية تبادل لإطلاق النار، وتسفر عن5.
ويمكن وصف مورفولوجيا وتشريح سامز قبل عدة أساليب مختلفة، بما في ذلك تقطيع تلطيخ نسيجية والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)6، اللتين تقدمت إلى حد كبير أرض للبحث من خلال توفير أما عرض الأقسام أو طريقة عرض سطح ثلاثي الأبعاد (3D) من سامز. ولكن كلا الأسلوبين وقتاً طويلاً، التي تنطوي على عدة خطوات تجريبية من إعداد نموذج للحصول على البيانات، وهذه الأساليب تعتمد أساسا على عينات ثابتة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص المجهري [كنفوكل] تقنية الليزر التغلب على هذه القيود وتزودنا بأداة قوية للتحقيق في البنية الخلوية والعملية التنموية لمصنع الأنسجة والأعضاء7،8. من خلال الضوئية بدلاً من الأنسجة الجسدية مجهرية [كنفوكل]، وتقطيع يتيح جمع سلسلة من الصور z-مكدس وإعادة 3D اللاحقة في العينة من خلال برمجيات تحليل الصورة.
هنا، يمكننا وصف إجراء فعال للتحقيق داخل ومصنع هياكل السطحية للمعيشة سامز من مختلف الأنواع باستخدام الليزر الفحص المجهري [كنفوكل]، الذي يحتمل أن يسمح للباحثين لإنجاز جميع التجريبية العملية داخل قصيرة بقدر 20 دقيقة. يختلف عن الأساليب الأخرى المنشورة لتصوير [كنفوكل] حية من نبات نورات سامز9،،من1011،،من1213،14، 15 و نبات الزهور13من12،، وهنا نثبت أن هذا البروتوكول ذات كفاءة عالية لدراسة ليس فقط في الخلايا الإنشائية نورات من الأنواع النموذجية ولكن أيضا تبادل لإطلاق النار الخضري قمية الخلايا الإنشائية من محاصيل مختلفة، مثل الطماطم، وفول الصويا. هذا الأسلوب لا يعتمد على علامات نيون المحورة وراثيا، ويحتمل أن يمكن تطبيقها على دراسة الخلايا الإنشائية تبادل لإطلاق النار من العديد من مختلف الأنواع والأصناف. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم أيضا صورة بسيطة تجهيز الخطوات لعرض وتحليل سامز مختلفة في عرض ثلاثي الأبعاد. أخذت معا، سيسهل هذا الأسلوب بسيطة الباحثين فهم كل من الهيكل والعملية التنموية للخلايا الإنشائية من طراز الكائنات الحية والمحاصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف أسلوب تصوير بسيطة التي يمكن تطبيقها لدراسة الخلايا الإنشائية قمية تبادل لإطلاق النار من نباتات مختلفة مع تعديلات طفيفة، فتح سبيلاً جديداً لدراسة لائحة مماثلة في مراحل الخضري والإنجابية سواء في محطات نموذجية و المحاصيل. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول على النقيض من وزارة شؤو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تقر “بوردو بندلي العلوم البيولوجية مركز التصوير مرفق” للحصول على ليزر المسح مجهر [كنفوكل]، والدعم التقني، والكتاب نقدر المساعدة من شبير أندي في “مرفق التصوير بندلي بوردو”. تم تمويل هذا النشاط بجامعة بوردو كجزء من أجسيد مفترق طرق التمويل لدعم الزراعة والتنمية الريفية في ولاية إنديانا.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
