קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים
Summary
פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.
Abstract
הפונקציות apical meristem (SAM) לירות כמו מאגר תאי גזע שנשמרת וזה יוצר כמעט לכל רקמות מעל פני הקרקע במהלך הפיתוח postembryonic. פעילותן ואת המורפולוגיה של סאמס לקבוע תכונות אגרונומית חשובים, כגון ארכיטקטורה לירות, הגודל והמספר של איברי הרבייה, וחשוב, התשואה תבואה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח המורפולוגיה השטח והן המבנה התאי פנימי של חיים סאמס ממינים שונים דרך מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. ההליך כולו משלב הכנת המדגם רכישת תמונות תלת מימד (3D) ברזולוציה גבוהה יכול להתבצע במרחק קצר ככל 20 דקות. נדגים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק התפרחת סאמס של המין מודל, אלא גם את meristems וגטטיבי של גידולים שונים, מתן כלי פשוט אך רב עוצמה כדי ללמוד את הארגון ואת התפתחות meristems על פני מינים שונים.
Introduction
Meristem הצמח מכיל מאגר של תאי גזע מובחן, ברציפות ומקיימת את צימוח איברים ואת פיתוח1. במהלך הפיתוח postembryonic, כמעט כל רקמות מעל פני הקרקע של צמח נגזרות של meristem apical לירות (SAM). בגידולים, פעילותן ואת גודל את סאם שלה meristems פרחוני נגזר הם קשורים בחוזקה רבים אגרונומית תכונות כגון ארכיטקטורה לירות, פירות ייצור זרע התשואה. לדוגמה, בעגבניה, סאם מוגדל גורמת עלייה הצילומים ואת תפרחת הסתעפות, ולכן התוצאות על מנת לייצר פרח נוסף ופרי איברים2. תירס, גידול בגודל סאם מוביל מספר הזרעים גבוה יותר, התשואה הכוללת3,4. סויה, indeterminacy meristem גם קשורה קשר הדוק עם הארכיטקטורה לירות, תשואה5.
מורפולוגיה של האנטומיה של סאמס יכולים להיות מאופיינת במספר שיטות, כולל היסטולוגית חלוקתה/צביעת וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)6, אשר שניהם יש קידמה מאוד את המחקר meristem באמצעות מתן תצוגת חתך או מבט תלת מימדי (3D) משטח של סאמס. אולם, שתי השיטות הן זמן רב, מעורבים מספר שלבים ניסיוני משלב הכנת המדגם אל, רכישת נתונים, שיטות אלה תלויים בעיקר מדגמים קבועים. התפתחויות אחרונות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקת לייזר היה להתגבר על מגבלות אלה ולספק לנו כלי רב עוצמה כדי לחקור את המבנה התאי ואת התהליך ההתפתחותי של הצמח רקמות ואיברים7,8. דרך אופטי ולא רקמה גופנית מיקרוסקופ קונפוקלי, אופטים מאפשר את האוסף של סדרה של תמונות z-מחסנית ושיחזור 3D עוקבות של המדגם באמצעות תוכנות ניתוח התמונה.
כאן, אנו מתארים הליך יעיל עבור חוקרים גם בפנים ולשתול משטח מבני המגורים סאמס מ שונים מינים באמצעות סריקת קונפוקלית, אשר פוטנציאל מאפשר לחוקרים לבצע כל את ניסיוני לייזר תהליך בתוך קצר ככל 20 דקות. שונה מכל שיטות נוספות שפורסמו בשידור חי הדמיה קונאפוקלית של תודרנית תפרחת סאמס9,10,11,12,13,14, 15 ו תודרנית פרחים12,13, כאן אנחנו מוכיחים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק את תפרחת meristems של המין מודל, אלא גם את הצילומים וגטטיבי meristems apical של גידולים שונים, כגון עגבניות, סויה. בשיטה זו אין להסתמך על סמנים פלורסנט הטרנסגניים ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם ללמוד את meristems לירות מתוך שפע מינים שונים של הזנים. בנוסף, אנחנו גם מציגים את התמונה פשוט עיבוד צפייה וניתוח סאמס שונים בתצוגה תלת-ממדית. יחדיו, שיטה פשוטה זו יקל על החוקרים להבין טוב יותר את המבנה ואת תהליך התפתחותי meristems דגם אורגניזמים והן יבולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים שיטה הדמיה פשוטה שניתן להחיל בחקר לירות apical meristems מצמחים שונים עם מינימאליים, פתיחת שדרה חדש ללמוד ברגולציה meristem בשלבים הן וגטטיבי לבין הרבייה בצמחים מודל ו יבולים. בניגוד SEM ופעולות היסטולוגית מוכתמים, פרוטוקול זה יכול לעזור לחשוף בתצוגת משטח והן מבנים הסלולר פנימי של סאמס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מתקן הדמיה מרכז פרדו Bindley Bioscience לגישה הלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי סורק, לתמיכה טכנית, ומסכים המחברים מעריך את העזרה של אנדי Schaber במתקן הדמיה Bindley פרדו. פעילות זו מומן על ידי אוניברסיטת פרדו כחלק AgSEED פרשת דרכים מימון לתמוך החקלאות ופיתוח הכפר של אינדיאנה.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
