Summary

Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

Published: March 29, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt Informationen zum live-Bild und analysieren schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie.

Abstract

Die schießen Sprossapikalmeristem Meristem (SAM) Funktionen wie einem konservierten Stammzell-Reservoir und es erzeugt fast alle oberirdischen Gewebe während der postembryonic Entwicklung. Die Aktivität und Morphologie von SAMs bestimmen wichtige agronomische Merkmale, wie schießen Architektur, Größe und Anzahl der Geschlechtsorgane, und vor allem Kornertrag. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Analyse der Morphologie der Oberfläche und die internen Zellstruktur des lebendigen SAMs aus verschiedenen Arten durch Laser-scanning-confocal Mikroskop. Das gesamte Verfahren von der Probenvorbereitung für den Erwerb von dreidimensionalen (3D) Bilder mit hoher Auflösung erreicht werden kann, innerhalb von 20 Minuten. Wir zeigen, dass dieses Protokoll ist für das Studium nicht nur der Blütenstand SAMs die Modell-Arten, sondern auch die vegetativen Meristeme aus verschiedenen Kulturen, bietet eine einfache, aber leistungsstarkes Tool zur Untersuchung der Organisation und Entwicklung von hocheffizienten Meristeme über verschiedene Pflanzenarten.

Introduction

Die Pflanze Meristem enthält einen Pool von undifferenzierten Stammzellen und kontinuierlich erhält die Orgel Pflanzenwachstum und Entwicklung1. Während der postembryonic Entwicklung stammen fast alle oberirdischen Gewebe einer Pflanze aus schießen Sprossapikalmeristem Meristem (SAM). In Kulturen sind die Aktivität und die Größe des SAM und seine abgeleiteten floral Meristeme viele agronomischen Eigenschaften wie Shooting Architektur, Obstbau und Samen Ertrag fest zugeordnet. Beispielsweise führt eine vergrößerte SAM in Tomate, eine Zunahme der schießen und Blütenstand Verzweigungen und damit Ergebnisse bei der Schaffung von zusätzlichen Blüte und Frucht Organe2. Bei Mais führt eine Zunahme SAM Größe zu einer höheren Ausgangszahl und Gesamtausbeute3,4. In Soja Meristem Unbestimmtheit ist auch eng verbunden mit der Shooting-Architektur und5.

Die Morphologie und Anatomie von SAMs können durch verschiedene Methoden, einschließlich der histologischen Schnitt/Färbung und Rasterelektronenmikroskopie (SEM)6, Scannen charakterisiert werden, die beide Meristem-Forschung durch die Bereitstellung von stark fortgeschrittenen haben die Schnittansicht oder eine dreidimensionale (3D) Oberflächenansicht von SAMs. Beide Methoden sind zeitaufwendig, an denen mehrere experimentelle Schritte von der Probenvorbereitung für die Datenerfassung, jedoch und diese Methoden hängen vor allem von örtlich festgelegten Proben. Jüngste Fortschritte in der Laser-scanning-Technik der konfokalen Mikroskopie haben diese Grenzen überwinden und uns ein mächtiges Werkzeug, um die Zellstruktur und Entwicklungsprozess des pflanzlichen Geweben und Organen7,8zu untersuchen. Durch optische anstatt physische Gewebe strukturierendes, konfokale Mikroskopie ermöglicht die Sammlung eine Reihe von Z-Stapel Bilder und die anschließende 3D-Rekonstruktion der Probe durch Bildanalyse-Software.

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Untersuchung sowohl innen und Oberflächenstrukturen des lebendigen SAMs aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie, wodurch potentiell Forscher, die experimentell zu erreichen Prozesse innerhalb von 20 Minuten. Anders als bei anderen veröffentlichten Methoden für live konfokale Abbildung von Arabidopsis Blütenstand SAMs9,10,11,12,13,14, 15 und Arabidopsis Blumen12,13, hier zeigen wir, dass dieses Protokoll ist sehr effizient für das Studium nicht nur den Blütenstand Meristeme der Modell-Arten, sondern auch die vegetativen schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Kulturen, wie Tomaten und Soja. Diese Methode setzt nicht auf transgene fluoreszierenden Marker und kann potenziell angewendet werden, um das Shooting Meristeme aus vielen verschiedenen Arten und Sorten zu studieren. Darüber hinaus führen wir auch einfache Bildverarbeitung Schritte zum Anzeigen und analysieren von verschiedenen SAMs in einer 3D-Ansicht. Zusammengenommen wird diese einfache Methode Forscher besser zu verstehen, die Struktur und Entwicklungsprozess des Meristeme von Modellorganismen und Kulturen erleichtern.

Protocol

(1) Medien und Bildgebung Gerichte-Vorbereitung MS Teller: 0,5 x Murashige & Skoog MS mittlere, 1 % Agar in entionisiertem Wasser hinzufügen und dann justieren pH bis 5.8 mit Kalilauge (Optional: Fügen Sie 1 % Saccharose für langfristige Pflanzenbau). Autoklaven und gießen Sie Platten. Imaging-Gerichte: füllen Sie Kunststoff Petrischalen (6 cm breit, 1,5 cm tief) auf 0,5-0,8 cm mit 1,5 % flüssige Agarose. (2) Pflanzenwachstum Arabidopsis Wach…

Representative Results

Um die Effizienz unseres Protokolls zu bewerten und die Morphologie der Meristeme verschiedener Arten zu erkunden, haben wir die konfokale live-imaging-Experimente an der Blütenstand Meristem von Arabidopsis und die vegetative Meristeme aus ausgeführt. Tomaten und Soja. In dieser Studie, Arabidopsis Ökotyp Landsberg Erecta, Tomaten Sorte Micro-Tom und Sojabohnen Sorte worden Williams 82 als Beispiele benutzt. <p class="jove_content" fo:keep-together.withi…

Discussion

Hier beschreiben wir eine einfache bildgebende Methode, die für die Untersuchung von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus unterschiedlichen Werken mit geringfügigen Änderungen angewendet werden kann öffnen einen neuen Weg um die Meristem-Verordnung an den vegetativen und reproduktiven Stadien in Modellpflanzen zu studieren und Pflanzen. Im Gegensatz zu die SEM und histologische Färbung Methoden helfen dieses Protokolls Oberflächenansicht und interne Zellstrukturen von SAMs, ohne die Notwendigkeit für arbeitsin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen Purdue Bindley Bioscience Center Imaging Facility für den Zugriff auf die Laser-scanning-confocal Mikroskop und für die technische Unterstützung, und die Autoren dankbar für die Hilfe von Andy Schaber in Purdue Bindley Imaging Facility. Diese Tätigkeit wurde von der Purdue University im Rahmen der AgSEED Kreuzung Mittel zur Förderung der Landwirtschaft und ländliche Entwicklung Indianas finanziert.

Materials

Agar Phyto Dot Scientific Inc. DSA20300-1000
Agarose Dot Scientific Inc. AGLE-500
Forceps  ROBOZ RS-4955 Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope  Zeiss
Murashige & Skoog MS medium Dot Scientific Inc. DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm CELLTREAT Scientific Products 229694 Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15 CELLTREAT Scientific Products 229665 Use as imaging dishes
Propagation Mix Sungro Horticulture
Propidium iodide Acros Organics 440300250 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade PERSONNA  62-0179 For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Tissue VWR 82003-820
Zen black Zeiss Image acquisition software

References

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Cite This Article
Geng, Y., Zhou, Y. Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species. J. Vis. Exp. (145), e59369, doi:10.3791/59369 (2019).

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