HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen
Summary
Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.
Abstract
CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)-vermittelten stabile topologisch Domänen zuordnen (TADs) spielen eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die im benachbarten TADs befinden. CTCF spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des räumlichen und zeitlichen Ausdrucks der HOX -Gene, die embryonale Entwicklung, Körper Musterung, Blutbildung und Leukemogenesis zu steuern. Es bleibt jedoch weitgehend unbekannt, ob und wie HOX Loci verbundenen CTCF Grenzen Chromatin Organisation und HOX -gen-Expression zu regulieren. In dem aktuellen Protokoll hat eine spezifische SgRNA gepoolte Bibliothek gezielt alle CTCF Bindungsstellen in den HOXA/B/C/D -Loci generiert, um die Auswirkungen der Störung CTCF-assoziierten Chromatin Grenzen auf TAD Bildung und HOX -gen untersuchen Ausdruck. Durch CRISPR-Cas9 wurde genetisches Screening, die CTCF Bindungsstelle befindet sich zwischen HOXA7/HOXA9 -Gene (CBS7/9) als kritische Regulator des onkogenen Chromatin Domäne sowie als wichtig für die Aufrechterhaltung der ektopische HOX -Gen identifiziert Expressionsmuster in neu geordnet, MLL akute myeloische Leukämie (AML). Also, diese SgRNA Bibliothek screening-Ansatz bietet neue Einblicke in CTCF vermittelte Genom-Organisation in spezifischen Gen-Loci und auch die Grundlage für die funktionelle Charakterisierung der kommentierten genetische regulatorischen Elemente, beide Codierung und Forensisches, während normale biologische Prozesse in der Post-humanen Genom-Projekt-Ära.
Introduction
Neuere Genom Interaktion Studien gezeigt, dass die menschliche Genom Formen topologisch verknüpfen Domänen (TADs) stabil, die in Zelle Arten und Arten konserviert sind. Die Organisation des Genoms in separaten Domänen erleichtert und schränkt die Wechselwirkungen zwischen regulatorische Elemente (z. B. Geschmacksverstärker und Promotoren). CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF) bindet an TAD Grenzen und spielt eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die in benachbarten TADs1befinden. Genom breite CTCF binden von Daten ergaben jedoch, dass obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen interagiert, es oft als Chromatin Barriere an einem bestimmten Standort in einer Zelle Art aber nicht in das andere dient, was darauf hindeutet, dass CTCF Funktionen zusammen mit den anderen Aktivitäten bei der Bildung von Chromatin Grenzen2. Unbekannt geblieben ist, ob der Randelemente (CTCF-Bindungsstellen) direkt auf die biologische Funktion von CTCF verknüpft sind, und wie diese Links auftreten. Daher vermuten wir, dass bestimmte CTCF Bindungsstellen im Genom direkt die Bildung von TADs regulieren und Promotor/Enhancer Interaktionen innerhalb dieser Domänen oder zwischen benachbarten Domänen zu kontrollieren. Die Vollendung von Mensch und Maus Genom-Sequenzierung Projekte und späteren epigenetischen Analysen haben neue molekulare und genetische Signaturen des Genoms aufgedeckt. Die Rolle der Signaturen/Anpassungen in der Genregulation und zelluläre Funktion sowie ihre molekulare Mechanismen müssen jedoch noch nicht vollständig verstanden werden.
Mehrere Linien des Beweises unterstützen, dass CTCF-vermittelten TADs funktionale Chromatin Domänen3,4,5darstellen. Obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen interagiert, zufolge Genom breite CTCF ChIP-Seq-Daten CTCF fungiert oft als Chromatin Barriere in einer Zelle Art aber nicht in die anderen2. CTCF spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von Vermittlung Genom Organisation4,6,7. Störung der CTCF Grenzen beeinträchtigt Enhancer/Promotor Interaktionen und Genexpression, was zu Entwicklungsstörungen Blockade. Dies deutet darauf hin, dass CTCF TADs vermittelt nicht nur strukturelle Komponenten, sondern auch regulatorische Einheiten für richtige Enhancer Aktion und gen Transkription5,8,9erforderlich sind.
HOX -Gene spielen eine kritische Rolle während der Embryonalentwicklung und sie sind zeitlich und räumlich eingeschränkt ihre Expressionsmuster. HOXA -Locus bildet zwei stabile TADs Front- und Seitenzahnbereich Gene durch eine CTCF-assoziierten Randelement in Zellkulturen und IMR90 Zellen1zu trennen. Die jüngsten Berichte zeigten, dass HoxBlinc, ein HoxB Locus verbunden LncRNA, die Bildung von CTCF vermittelt TADs und Enhancer/Promotor Interaktionen in den HOXB Locus gerichtet. Dies führt zu anterioren HOXB Genaktivierung bei ESC Engagement und Differenzierung10. Darüber hinaus an bestimmte gen-Loci einschließlich der HOXA -Lokus, Änderung der CTCF TAD Domänen geändert Linie spezifisches Gen Expressionsprofile vermittelt und wurde im Zusammenhang mit der Entwicklung der Krankheit Staaten11,12. Der Beweis stützt eine primäre Funktion für CTCF Gentranskription koordinieren und Bestimmung der Zelle Identität durch die Organisation des Genoms in Funktionsbereiche.
Trotz seiner Rolle in der embryonalen Entwicklung, während der Hämatopoese regulieren HOX -Gene hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HS/PC) Zellfunktion. Dies geschieht durch die Förderung des Gleichgewichts zwischen Proliferation und Differenzierung10,13,14,15. Der Ausdruck der HOX -Gene ist streng reguliert, während die Spezifikation und die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen mit höchsten Ausdruck in HS / Stk. HOX -gen-Expression sinkt allmählich während der Reifung, mit den niedrigsten Stand Auftritt unterschieden hämatopoetischen Zellen16. HOX -gen Dysregulation ist eine dominante Mechanismus der leukämischen Transformation durch Dysregulating Selbsterneuerung und Differenzierung Eigenschaften der HS/PCs zu leukämischen Transformation17,18. Der Mechanismus der Einführung und Aufrechterhaltung von Normal vs. onkogenen Expressionsmuster der HOX -Gene sowie damit verbundenen Regulationsnetzwerke bleibt jedoch unklar.
CRISPR-Cas9-SgRNA-Bibliothek-Screening wurde weithin verwendet, um Protein-kodierenden Gene19 als auch als nicht-kodierenden Gene, z. B. LncRNA20 und MiRNA21 in verschiedenen Arten zu verhören. Die Kosten die CRISPR-Cas9-SgRNA-Bibliothek verwenden, um neue genomische Ziele identifizieren bleibt jedoch hoch, da Hochdurchsatz-Genoms oft angewendet wird, um zu überprüfen, die SgRNA-Bibliothek-Screening. Unsere SgRNA screening-System konzentriert sich auf die spezifischen Genom-Loci und wertet das targeting SgRNAs durch One-Step RT-PCR nach der Marker-gen-Expression, z. B. HOXA9. Darüber hinaus kann Sanger-Sequenzierung bestätigt, dass die SgRNA in das Genom und Indel Mutationen integriert wurde erkannt werden, um die SgRNA Ausrichtung der Website zu identifizieren. Durch die Loci-spezifische CRISPR-Cas9 genetisches Screening, wurde die CBS7/9-Chromatin-Grenze als kritische Regulator für onkogenen Chromatin Domäne Aufbau und Pflege von ektopische HOX gen Expressionsmuster in AML Pathogenese identifiziert 12. die Methode kann weit angewendet werden, um nicht nur spezifische Funktion von CTCF Grenze in der Embryonalentwicklung, Blutbildung, Leukemogenesis, aber auch CTCF Grenze als mögliche therapeutische Ziele für künftige epigenetische Therapie zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-kodierenden gen bezogene SgRNA Bibliotheken in einem funktionalen Screeningsystem zur Identifizierung von Genen und Netzwerke zur Regelung bestimmter Zellfunktionen durch SgRNA Bereicherung24,25,26 angewendet wurden ,27,28. Mehrere nicht-kodierende Region bezogene SgRNA Bibliotheken zeigten sich auch in Gen-spezifischen funktionalen Bildschirme für d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken auch Nicholas Cesari für das Manuskript zu bearbeiten. Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health (s.h., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
