HOX المكاني مركزة كريسبر/سجرنا "مكتبة الفرز تحديد الحرجة كتكف الحدود"
Summary
مكتبة كريسبر/سجرنا طبق لاستجواب الجينات ترميز البروتين. بيد أن جدوى مكتبة سجرنا للكشف عن الوظيفة لحد كتكف في تنظيم الجينات لا تزال غير مستكشفة. هنا، يمكننا وصف مكتبة HOX سجرنا محددة المكاني لتوضيح وظيفة الحدود كتكف في HOX المكاني.
Abstract
عامل ملزم كككتك (كتكف)-وساطة مستقرة توبولوجيكالي الربط بين المجالات (تادس) تلعب دوراً هاما في التفاعلات المقيدة لعناصر الحمض النووي التي تقع في المجاورة تادس. كتكف دوراً هاما في تنظيم التعبير المكاني والزماني HOX الجينات التي تتحكم في التطور الجنيني والزخرفة الجسم، هيماتوبويسيس، وليوكيموجينيسيس. بيد أنها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير وكيفية تنظيم HOX المكاني المرتبطة كتكف حدود منظمة الكروماتين والتعبير الجيني HOX . في البروتوكول الحالي، قد تم إنشاء مكتبة مجمعة سجرنا محددة تستهدف جميع مواقع الربط CTCF في المكاني هوكسا/ب/ج/د لدراسة آثار الإخلال بالحدود المرتبطة CTCF الكروماتين على تشكيل صبي و HOX الجينات التعبير. تم التعرف على من خلال كريسبر-Cas9 الفرز الجيني، الموقع ملزم كتكف الواقعة بين الجينات HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) كمنظم حرجة من المجال النمطان الكروماتين، فضلا عن الأهمية للمحافظة على حمل خارج الرحم HOX الجينات أنماط التعبير في اللوكيميا النقوي الحاد MLL ترتيبها (مكافحة غسل الأموال). وهكذا، هذه المكتبة سجرنا فحص نهج يوفر نظرة ثاقبة رواية CTCF وساطة منظمة الجينوم في مواضع محددة من الجينات ويوفر أيضا أساسا لتوصيف وظيفي من العناصر التنظيمية الوراثية المشروح، وكلا الترميز و فضله، خلال العمليات البيولوجية الطبيعية في عصر الجينوم البشري بعد انتهاء المشروع.
Introduction
كشفت دراسات التفاعل الجينوم مؤخرا أن أشكال الجينوم البشري النووية مستقرة مجالات ربط توبولوجيكالي (تادس) التي يتم المحافظة عليها عبر أنواع الخلايا والأنواع. منظمة المجين في مجالات منفصلة وييسر ويحد من التفاعلات بين العناصر التنظيمية (مثل القدرة على والمروجين). يربط الحدود تاد عامل ملزم كككتك (كتكف) ويقوم بدور حاسم في التفاعلات المقيدة لعناصر الحمض النووي التي تقع في المجاورة تادس1. ومع ذلك، كشفت الجينوم واسعة CTCF ربط البيانات أنه على الرغم من أن معظمهم CTCF يتفاعل مع الحمض النووي-المواقع نفسها في أنواع مختلفة من الخلايا، غالباً ما تعمل كحاجز الكروماتين في موقع معين في نوع خلية واحدة ولكن ليس في غيرها، مما يوحي بأن وظائف كتكف جنبا إلى جنب مع الأنشطة الأخرى في تكوين الكروماتين حدود2. هو ما لا يزال غير معروف ما إذا كانت عناصر الحدود (كتكف-ربط المواقع) ترتبط مباشرة بالوظيفة البيولوجية كتكف، وكيفية حدوث هذه الارتباطات. ولذلك، نحن افترض أن CTCF ملزم مواقع محددة في الجينوم مباشرة تنظيم تشكيل تادس ومراقبة المروج/محسن التفاعلات داخل هذه المجالات أو بين المجالات المجاورة. الانتهاء من الإنسان ومشاريع تسلسل الجينوم الماوس وتحليلات جينية اللاحقة كشفت تواقيع جديدة الجزيئية والوراثية للجينوم. بيد أن دور التواقيع/تعديلات محددة في تنظيم الجينات ووظيفة الخلوية، فضلا عن الآليات الجزيئية، لم يفهم تماما.
دعم خطوط متعددة من الأدلة أن تمثل تادس CTCF بوساطة الكروماتين الوظيفية المجالات3،4،5. على الرغم من أن معظمهم CTCF يتفاعل مع الحمض النووي-المواقع نفسها في أنواع مختلفة من الخلايا، وكشفت البيانات CTCF رقاقة-seq واسعة الجينوم أن كتكف غالباً ما يعمل كحاجز الكروماتين في نوع خلية واحدة ولكن ليس في غيرها2. كتكف دوراً أساسيا أثناء تطوير طريق التوسط الجينوم المنظمة4،،من67. تعطيل الحدود CTCF البصر التفاعلات محسن/المروج والتعبير الجيني، مما يؤدي إلى انسداد التنموية. وهذا يوحي بأن كتكف بوساطة تادس المكونات الهيكلية، ليس فقط ولكن أيضا الوحدات التنظيمية اللازمة لمحسن سليم العمل والجينات النسخ5،،من89.
HOX الجينات تلعب أدواراً حاسمة خلال التطور الجنيني وأنها مقيدة زمنياً ومكانيا في أنماط التعبير. يشكل محور هوكسا تادس مستقرة اثنين فصل الجينات الأمامي والخلفي بعنصر حدود المرتبطة كتكف في هيسكس و الخلايا IMR901. أظهرت التقارير الأخيرة أن هوكسبلينك، حزب موضع المرتبطة لنكرنا، يتوسط تشكيل CTCF توجه تادس والتفاعلات محسن/المروج في محور حزب . وهذا يؤدي إلى تنشيط الجينات حزب الأمامي خلال ESC الالتزام والتمايز10. وعلاوة على ذلك، في جين معين المكاني بما في ذلك محور هوكسا ، تغيير CTCF وساطة تاد المجالات تغيرت النسب جين معين التعبير التشكيلات الجانبية، وترافق مع تطور المرض الدول11،12. وتؤيد الأدلة وظيفة أساسية كتكف في تنسيق النسخ الجينات وتحديد هوية الخلية بتنظيم الجينوم في المجالات الفنية.
وعلى الرغم من دورها في التنمية الجنينية، أثناء هيماتوبويسيس، تنظيم HOX الجينات المكونة للدم وظيفة الخلية (HS/PC) الجذعية والسلف. وهذا يتم عن طريق التحكم في التوازن بين الانتشار والتمايز10،13،،من1415. أحكام تنظم HOX الجينات طوال بمواصفات والتفريق بين الخلايا المكونة للدم، مع التعبير أعلى في النظام المنسق/أجهزة الكمبيوتر- HOX الجينات يتناقص بالتدريج خلال النضج، مع أدنى المستويات المتباينة التي تحدث في الخلايا المكونة للدم16. HOX الجينات التقلبات إليه مهيمنة للتحول ليوكيميك بخصائص ديسريجولاتينج الذاتي تجديد والتمايز HS/أجهزة الكمبيوتر مما أدى إلى تحول ليوكيميك17،18. ومع ذلك، الآلية لإنشاء وصيانة عادية مقابل أنماط التعبير النمطان HOX الجينات، فضلا عن الشبكات التنظيمية المرتبطة بها لا يزال غير واضح.
فحص مكتبة سجرنا كريسبر-Cas9 قد استخدمت على نطاق واسع لاستجواب الجينات ترميز بروتين19 كالجينات جيدا كما غير الترميز، مثل لنكرنا20 وميرنا21 في الأنواع المختلفة. بيد أن تكلفة استخدام المكتبة سجرنا كريسبر-Cas9 لتحديد أهداف جديدة في الجينوم لا تزال عالية، لأنه غالباً ما يتم تطبيق تسلسل الجينوم الفائق للتحقق من عرض مكتبة سجرنا. لدينا سجرنا فحص نظام يركز على مواضع محددة من الجينوم ويقيم سجرناس الاستهداف من خلال خطوة واحدة RT-PCR وفقا لتعبير الجينات ماركر، مثل HOXA9. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن سانغر التسلسل وأكد أن سجرنا أدمجت في الجينوم، والطفرات إينديل لتحديد سجرنا استهداف الموقع. من خلال الفحص الجيني المكاني على حدة كريسبر-Cas9، تم التعرف على حدود الكروماتين CBS7/9، كمنظم حاسمة لإنشاء المجال النمطان الكروماتين والحفاظ على أنماط التعبير الجيني HOX حمل خارج الرحم في المرضية مكافحة غسل الأموال 12-يمكن تطبيق الأسلوب على نطاق واسع لتحديد وظيفة معينة ليس فقط من الحدود كتكف في التنمية الجنينية، هيماتوبويسيس، ليوكيموجينيسيس، ولكن أيضا الحدود CTCF كالأهداف العلاجية المحتملة للعلاج جينية مستقبلا.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتين-ترميز الجينات المتعلقة بالمكتبات سجرنا قد طبقت في نظام فرز وظيفية لتحديد الجينات وشبكات تنظيم الوظائف الخلوية المحددة من خلال سجرنا تخصيب24،،من2526 ،،من2728. المنطقة غير الترميز عدة تتعلق بال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كما يشكر المؤلفون سيزاري نيكولاس لتحرير المخطوطة. وأيد الأعمال المنح المقدمة من “المعهد الوطني للصحة” (أدمغة، R01DK110108، R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
