HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen
Summary
Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.
Abstract
CCCTC-bindende factor (CTCF)-gemedieerde stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) spelen een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich bevinden in het naburige TADs. CTCF speelt een belangrijke rol bij de regulering van de ruimtelijke en temporele expressie van HOX -genen waarmee embryonale ontwikkeling, lichaam patronen, Haematopoiese en leukemogenesis. Het blijft echter grotendeels onbekend of en hoe HOX loci verbonden CTCF grenzen chromatine organisatie en expressie van HOX -genen regelen. In het huidige protocol, is een specifieke sgRNA gepoolde bibliotheek gericht op alle CTCF bandplaatsen in de HOXA/B/C/D loci gegenereerd om te onderzoeken van de effecten van CTCF-geassocieerde chromatine grenzen op TAD vorming en HOX gen verstoren expressie. Via CRISPR-Cas9 is genetische screening, de CTCF binding site gelegen tussen HOXA7/HOXA9 genen (CBS7/9) geïdentificeerd als een kritische regulator van oncogene chromatine domein, maar ook als belangrijk voor het behoud van ectopische HOX -genen expressiepatronen in MLL-herschikt acute myeloïde leukemie (AML). Dus, deze sgRNA bibliotheek screening aanpak biedt nieuwe inzichten in CTCF gemedieerde genoom organisatie in specifiek gen loci en biedt ook een basis voor de functionele karakterisering van de geannoteerde genetische regelgevende elementen, zowel codering en Noncoding, tijdens normale biologische processen in het post-menselijke genoom project tijdperk.
Introduction
Recente genoom interactie onderzoek uitgewezen dat het menselijk genoom van de nucleaire vormen stabiele topologisch associëren domeinen (TADs) die zijn bewaard in de celtypen en soorten. De organisatie van het genoom in aparte domeinen vergemakkelijkt en interacties tussen regelgevende elementen (bijvoorbeeld versterkers en initiatiefnemers) beperkt. De CCCTC-bindende factor (CTCF) bindt aan TAD grenzen en speelt een cruciale rol in beperkende interacties van DNA-elementen die zich in aangrenzende TADs1 bevinden. Echter, genoom-brede CTCF bindende gegevens bleek dat hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, het vaak als een barrière van de chromatine op een specifieke site in één celtype maar niet in de andere fungeert, wat suggereert dat CTCF-functies samen met andere activiteiten in de vorming van chromatine grenzen2. Wat blijft onbekend is of de grens elementen (CTCF-bandplaatsen) rechtstreeks gekoppeld zijn aan de biologische functie van CTCF, en hoe deze koppelingen optreden. We veronderstellen daarom dat specifieke CTCF bandplaatsen in het genoom direct de vorming van TADs regelen en promotor/versterker interacties binnen deze domeinen of tussen naburige domeinen. De voltooiing van de mens en de muis genoom sequencing projecten en de daaropvolgende epigenetische analyses hebben ontdekt nieuwe moleculaire en genetische handtekeningen van het genoom. De rol van specifieke handtekeningen/wijzigingen in genexpressie en cellulaire functie, evenals hun moleculaire mechanism(s), moeten echter nog volledig worden begrepen.
Meerdere lijnen van bewijsmateriaal ondersteunen dat de CTCF-gemedieerde TADs functionele chromatine domeinen3,4,5 vertegenwoordigen Hoewel CTCF meestal met dezelfde DNA-sites in verschillende celtypen communiceert, bleek genoom-brede CTCF ChIP-seq gegevens dat de CTCF vaak als een barrière van de chromatine in één celtype maar niet in de andere2 fungeert. CTCF speelt een essentiële rol tijdens de ontwikkeling door het genoom organisatie4,6,7te bemiddelen. Verstoring van de CTCF grenzen verminderde versterker/promotor interacties en genexpressie, leidt tot ontwikkelingsstoornissen verstopping. Dit suggereert dat CTCF TADs gemedieerde zijn niet alleen de structurele onderdelen, maar ook de regelgevende eenheden vereist voor een juiste versterker actie en gene transcriptie5,8,9.
HOX -genen spelen een kritieke rol tijdens de embryonale ontwikkeling en ze zijn stoffelijk als ruimtelijk beperkt in hun expressiepatronen. De locus HOXA vormt twee stabiele TADs anterior en posterior genen te scheiden door een element van de CTCF-geassocieerde grens in zowel hESCs als IMR90 cellen1. Uit recente rapporten blijkt dat HoxBlinc, een HoxB verbonden locus lncRNA, de vorming van CTCF bemiddelt geregisseerd TADs en versterker/promotor-interacties in de locus HOXB . Dit leidt tot anterior HOXB gene activering tijdens ESC inzet en differentiatie10. Anderzijds op specifiek gen loci met inbegrip van het HOXA locus, wijziging van de CTCF gemedieerde TAD domeinen veranderd lineage specifiek gen expressieprofielen en werd geassocieerd met de ontwikkeling van ziekte staten11,12. Het bewijs ondersteunt een primaire functie voor CTCF in coördinatie van de transcriptie van het gen en het bepalen van de cel identiteit door het organiseren van het genoom in functionele domeinen.
Ondanks haar rol in de ontwikkeling van het embryo, tijdens Haematopoiese, reguleren HOX -genen hematopoietische stamcellen en voorlopercellen functie van de cel (HS/PC). Dit wordt gedaan door het beheersen van het evenwicht tussen de proliferatie en differentiatie10,13,14,15. De expressie van HOX -genen is strak geregeld gedurende de specificatie en de differentiatie van hematopoietische cellen, met de hoogste expressie in HS / PCs. HOX genexpressie daalt geleidelijk tijdens de rijping, met het laagste niveau die zich in gedifferentieerde hematopoietische cellen16. HOX gene disregulatie is een dominante mechanisme van leukemische transformatie door dysregulating eigenschappen van de zelf-vernieuwing en differentiatie van HS/PCs leidt tot leukemische transformatie17,18. Het mechanisme van het opzetten en onderhouden van de normale vs. oncogene expressiepatronen van HOX -genen, alsmede bijbehorende regulerende netwerken blijft echter onduidelijk.
CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotheek screening is wijd verbeid gebruikt om te ondervragen van eiwit-codeert genen19 als ook als niet-codeert genen, zoals lncRNA20 en miRNA21 in verschillende soorten. De kosten voor het gebruik van de CRISPR-Cas9-sgRNA-bibliotheek te identificeren van nieuwe genomic doelstellingen blijft echter hoog, omdat high-throughput genoom sequencing vaak toegepast wordt om te controleren of de sgRNA bibliotheek screening. Onze sgRNA screening systeem is gericht op de specifieke genoom loci en resulteert in de targeting sgRNAs via one-step RT-PCR volgens de genexpressie markering, zoals HOXA9. Bovendien kan Sanger sequencing bevestigd dat de sgRNA werd geïntegreerd in het genoom, en Indel mutaties worden gedetecteerd om te identificeren van de sgRNA dat targeting site. Via de loci-specifieke CRISPR-Cas9 genetische screening, is de grens van de chromatine CBS7/9 geïdentificeerd als een kritische regulator voor totstandbrenging oncogene chromatine domein en het onderhoud van ectopische HOX gen expressiepatronen in AML pathogenese 12. de methode kan algemeen worden toegepast om te identificeren niet alleen specifieke functie van de CTCF grens in de embryonale ontwikkeling, Haematopoiese, leukemogenesis, maar ook CTCF grens als therapeutisch doelwit voor toekomstige Epigenetische therapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eiwit-codeert genen gerelateerde sgRNA bibliotheken zijn toegepast in een functionele screening systeem op identificatie van genen en netwerken regulering van de specifieke cellulaire functies via sgRNA verrijking24,25,26 ,27,28. Verschillende niet-coderende regio gerelateerde sgRNA bibliotheken werden ook getoond in gen-specifieke functionele screens voor di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken ook Nicholas Cesari voor het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
