Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis
Summary
Cluster de proteínas do receptor germinant em ‘germinosomes’ na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.
Abstract
O pequeno tamanho dos esporos e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, causar dificuldades em suas análises microscópicas usando microscopia de epifluorescência. Super-resolução tridimensional estruturada iluminação microscopia (3D-SIM) é uma ferramenta promissora para superar este obstáculo e revelar os detalhes moleculares do processo de germinação de esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis). Aqui, descrevemos o uso de um SIMcheck modificado (ImageJ)-processo de imagem 3D assistente e proteínas fluorescentes repórter para microscopia SIM de germinosomes dos esporos de b. subtilis , clusters de proteínas de germinação. Apresentamos também um procedimento de imagem 3D-SIM (padrão) para FM4-64 coloração das membranas de esporos de b. subtilis . Usando estes procedimentos, obteve resolução insuperável para a localização de germinosome e mostrar que > 80% de b. subtilis KGB80 esporos dormentes obtidos após esporulação no meio de MOPS mínimo definido têm um ou dois GerD-GFP e GerKB-mCherry focos. Focos luminosos também foram observados em FM4-64 manchado imagens de 3D-SIM dos esporos sugerindo que domínios de lipídios de membrana interna de fluidez diferente provável existirem. Mais estudos que usam dupla rotulagem procedimentos com corantes de membrana e germinosome proteínas repórter para avaliar localização co e, assim, obter uma óptima visão geral da organização das proteínas de germinação de Bacillus na membrana interna dos esporos são possível.
Introduction
Esporos das ordens Bacillales e Clostridiales são metabolicamente inativo e extraordinariamente resistente aos regimes de descontaminação dura, mas a menos que germinam, não podem causar efeitos deletérios em seres humanos1. Em nutriente germinant desencadeada germinação dos esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis), o evento de iniciação é germinant ligação a receptores germinant (GRs), localizado na membrana interna do spore (IM). Posteriormente, as GRs transduce sinais à proteína de canal SpoVA também localizado no IM. Isso resulta no início da troca de esporo núcleo piridina-2,6-de ácido dicarboxílico (ácido dipicolínico; DPA; composto por 20% dos esporos núcleo seco wt) para a água através do canal SpoVA. Posteriormente, o lançamento DPA desencadeia a ativação da hidrólise de peptidoglicano do córtex, e absorção de água adicionais segue2,3,4. Esses eventos levam ao estresse mecânico sobre as camadas de revestimento, sua ruptura subsequente, o aparecimento de consequência e, finalmente, crescimento vegetativo. No entanto, os detalhes exatos moleculares do processo de germinação são ainda longe de resolvida.
Uma grande questão sobre a germinação dos esporos diz respeito as propriedades biofísicas dos lipídeos em torno das proteínas de germinação de IM, bem como as proteínas de canal SpoVA IM. Este imóvel em grande parte lipídica IM é a barreira de permeabilidade principal para muitas moléculas pequenas, incluindo preservativos químicos tóxicos, alguns dos quais exercem sua ação no núcleo do esporo ou no citoplasma de células vegetativas5,6. A bicapa lipídica IM é provável que em um estado de gel, embora haja uma fração significativa de lipídios móveis no IM5. IM do esporo também tem o potencial de expansão significativa5. Assim, aumenta a área de superfície do IM 1.6-fold sobre a germinação sem síntese de membrana adicional e é acompanhada pela perda de característico baixa permeabilidade e lipídios imobilidade5,6 de uma membrana.
Enquanto os detalhes moleculares da ativação de proteínas germinação e organização dos lipídios IM em esporos são temas atraentes para estudo, o tamanho pequeno de esporos de b. subtilis e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, representam um desafio para análises microscópicas. Griffiths et al. evidências de microscópio de epifluorescência convincentes, usando fluorescentes repórteres fundidos às proteínas de germinação, sugere que em esporos de b. subtilis a proteína de andaime GerD organiza três subunidades GR (A, B e C) de GerA, B e K GRs, em um cluster7. Eles cunhou o termo ‘germinosome’ para este cluster de proteínas germinação e descreveu as estruturas como ~ 300 nm grande IM proteína focos8. Ao iniciar a germinação dos esporos, germinosome fluorescente focos, finalmente, transformar em maior dispersar padrões fluorescentes, com > 75% das populações esporo exibindo este padrão em esporos germinados para 1 h com L-valina8. Observe que o livro mencionado acima usado em média imagens de dezenas de fotos fluorescentes consecutivas, para ganhar poder estatístico e superar o obstáculo da baixos sinais fluorescentes observados durante a imagem latente. Esta visualização destas estruturas em esporos bacterianos foi no limite do que é tecnicamente viável com ferramentas microscópicas clássicas e nem uma avaliação da quantidade de focos em um único esporo nem foi sua localização subcellular mais detalhada possível com esta abordagem.
Aqui, vamos demonstrar o uso de estruturada iluminação microscopia (SIM) para obter uma visualização detalhada e quantificação do germinosome(s) em esporos de b. subtilis, bem como de seus IM lipídico domínios9. O protocolo também contém instruções para a esporulação, slide preparação e análise de imagens por SIMcheck (v 1.0, um plugin do imageJ) bem como ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado contém um procedimento padrão do 3D-SIM para análise de FM4-64 manchadas de esporos de b. subtilis que inclui esporulação, preparação de slide e processos de imagem. Além disso, o protocolo descreve um SIMcheck modificado (ImageJ)-assistida de processo para microscopia SIM de b. subtilis esporo germinosomes rotulado com fluorescentes repórteres de imagem 3D. O último procedimento nos permitiu observar esta subestrutura ofuscante com contraste aprimorado. Pelo acoplament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Christiaan Zeelenberg por sua assistência durante a imagem SIM. JW reconhece Conselho de bolsa da China para uma bolsa de doutorado e obrigado Irene Stellingwerf por sua ajuda durante a fase primária da imagem.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
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