Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar
Summary
Germinant reseptör proteinler ‘germinosomes’ Bacillus subtilis sporlar iç zarda kümesinde. Biz süper çözünürlük mikroskobu ve floresan muhabir proteinleri germinosomes görselleştirmek için bir iletişim kuralı’nı açıklar. İletişim kuralı da tercihen membran boya FM4-64 ile lekeli spor iç zar etki alanları tanımlar.
Abstract
Sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk neden epifluorescence mikroskobu kullanarak onların Mikroskopik analizler zorluklar. Süper çözünürlük üç boyutlu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) bu engeli aşmak ve Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar çimlenme sürecinin moleküler ayrıntıları ortaya çıkarmak için umut verici bir araçtır. Burada, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) nasıl kullanılacağını açıklar-Yardımcısı 3D görüntüleme işlemi ve floresan muhabir proteinler B. subtilis sporlar germinosomes, kümelere çimlenme proteinlerin SIM mikroskopi için. B. subtilis spore zarı FM4-64 boyama için (Standart) 3D-SIM görüntüleme yordamı da mevcut. Bu yordamları kullanarak germinosome yerelleştirme için eşsiz çözünürlük elde edilen ve gösteri > uyuyan sporlar elde sporulation tanımlanmış en az BEZLERİ orta sonra B. subtilis KGB80% 80’i-si olmak bir ya da iki GerD-GFP ve GerKB-mCherry resimde. Parlak foci Ayrıca içinde gözlenen FM4-64 sporlar 3D-SIM görüntüleri iç membran lipid etki alanından farklı akışkanlık olasılığı bulunduğunu düşündüren lekeli edildi. Daha fazla co yerelleştirme değerlendirmek ve böylece en iyi genel Bacillus çimlenme proteinlerin kuruluşun iç spore membran almak için çift muhabir proteinler membran boyalar ve germinosome yordamları etiketleme kullanın çalışmalar vardır mümkün.
Introduction
Sporlar siparişlerin Bacillales ve Clostridiales metabolik olarak uyuyan ve olağanüstü dayanıklı sert dekontaminasyon rejimler, ama onlar çimlenme sürece, zararlı etkileri insanlar1‘ neden olamaz. İçinde besin germinant tetiklenen çimlenme Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar, inisiyasyon olay germinant reseptörleri (gr) Spor’ın iç zar (IM) yer alan germinant bağlamadır. Daha sonra GRs sinyalleri de IM içinde bulunan SpoVA kanal protein transduce. Bu spor çekirdek pyridine-2,6-Dikarboksilik asit (dipicolinic asit; Satım başlangıcı olur DPA; spore çekirdek kuru wt % 20’si oluşan) SpoVA kanal üzerinden su için. Daha sonra korteks peptidoglikan hidroliz aktivasyonu DPA serbest tetikler ve2,3,4ek su alımını izler. Bu olaylar için mekanik stres yol kat kat, onun sonraki rüptürü, akıbet başlangıcı ve son olarak, bitkisel büyüme. Ancak, çimlenme işleminin tam moleküler ayrıntılarını hala uzakta çözümlenir.
Spor çimlenmesi hakkında önemli bir soru IM çimlenme proteinler ve IM SpoVA kanal proteinler çevreleyen lipidler biyofiziksel özellikleri ile ilgili. Bu büyük ölçüde hareketsiz IM lipid bilayer bazıları kendi eylem spor çekirdek veya bitkisel hücre sitoplazma5,6sarfetmek toksik kimyasal koruyucu dahil olmak üzere birçok küçük moleküller için ana geçirgenliği engeldir. IM5mobil lipidler önemli bir kısmını olsa bir jel durumda IM lipid bilayer olasıdır. Spore’s IM de önemli genişleme5için potansiyele sahiptir. Böylece, 1.6-fold IM yüzey alanını artırır çimlenme olmadan ek membran sentezi üzerine ve bu zar’ın karakteristik düşük geçirgenlik ve lipid hareketsizlik5,6kaybı tarafından eşlik ediyor.
Çimlenme proteinler aktivasyonu ve sporlar IM lipidler organizasyonu moleküler ayrıntılarını çalışma için çekici konular olsa da, B. subtilis sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk bir meydan okuma teşkil Mikroskopik analizler için. Griffiths vd. epifluorescence mikroskop kanıt zorlayıcı, floresan gazetecilere çimlenme proteinler için erimiş kullanarak önerir B. subtilis sporlar üç GR alt birimleri (A, B ve C) GerA, B ve K GRs iskele protein GerD düzenler, bir küme7‘. Bu küme çimlenme proteinlerin için ‘germinosome’ terim icat ve yapıları ~ 300 nm büyük IM protein foci8olarak nitelendirdi. Spor çimlenmesi başlatılması floresan germinosome foci sonuçta değiştirmek içine daha büyük dağıtmak floresan desenleri ile > sporlar bu modeli görüntüleme spore nüfusun % 75 germinated L-Valin8ile 1 h için. Kullanılan yukarıda belirtilen kağıt istatistiksel güç kazanmak ve görüntüleme sırasında gözlenen düşük floresan sinyallerini engeli aşmak için ardışık floresan resimlerin düzinelerce görüntülerden ortalama Not. Bu görselleştirme bakteriyel sporlar bu yapıların klasik mikroskobik araçları ve ben de foci bir tek spor miktarı değerlendirilmesi teknik açıdan ne de ne de onların daha ayrıntılı hücre altı yerelleştirme yapıldı Bu yaklaşım ile mümkün.
Burada, biz, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (detaylı görsel öğeyi almak için SIM) kullanımı ve sporlar B. subtilisyanı sıra kendi IM lipid etki alanları9germinosome(s) miktar göstermek. Protokol için de yönergeler sporulation, slayt hazırlama ve görüntü analizi SIMcheck (v1.0, bir imageJ eklenti) tarafından ImageJ10,11,12yanı sıra içermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan Protokolü FM4- B. subtilis sporlar lekeli sporulation, slayt hazırlama ve işlemleri görüntüleme içeren 64 çözümlenmesi için bir standart 3D-SIM yordam içerir. Ayrıca, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) protokolünü açıklar-işlem için SIM mikroskobu ile floresan gazetecilere etiketli B. subtilis spor germinosomes, Imaging 3D destekli. İkinci yordamı bu loş altyapı geliştirilmiş kontrast ile gözlemlemek için bize izin. İki görüntüleme yordam kaplin tarafından böylec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Christiaan Zeelenberg SIM görüntüleme sırasında yaptığı yardım için teşekkür ederiz. JW Çin burs Konseyi için bir Doktora Bursu kabul eder ve Irene Stellingwerf görüntüleme birincil aşaması sırasında ona yardım için teşekkürler.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
