Summary
Ongebreidelde luchtdruk wordt gebruikt om het patroon van het inademen van wakkere muizen te kwantificeren. We laten zien dat 15 s segmenten onder een gestandaardiseerd protocol vergelijkbare waarden weergeven als een langere duur van stille ademhaling. Deze methodologie maakt het ook mogelijk voor de kwantificering van apneu en verhoogde ademhalingen tijdens het eerste uur in de kamer.
Abstract
Ongebreidelde barometerplethysmografie (UBP) is een methode voor het kwantificeren van het patroon van de ademhaling in muizen, waar ademhalingsfrequentie, getijdenvolume en minieme ventilatie routinematig worden gerapporteerd. Bovendien kan informatie worden verzameld over de neurale output van de ademhaling, met inbegrip van het bestaan van centrale apneu en verhoogde ademhalingen. Een belangrijke overweging voor UBP is het verkrijgen van een ademhalingssegment met een minimale impact van angstig of actief gedrag, om de reactie op ademhalingsuitdagingen op te helderen. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor korte, rustige basislijnen worden verkregen in oude muizen, vergelijkbaar met wachten op langere periodes van stille ademhaling. Het gebruik van kortere tijdsegmenten is waardevol, omdat sommige muizenstammen in toenemende mate prikkelbaar of angstig kunnen zijn, en langere perioden van stille ademhaling mogelijk niet binnen een redelijke termijn worden bereikt. We plaatsten 22 maanden oude muizen in een UBP-kamer en vergeleken vier 15 s stille ademhaling segmenten tussen minuten 60-120 tot een langere 10 minuten rustige ademperiode die 2-3 uur duurde om te verwerven. We verkregen ook tellingen van centrale apneu en verhoogde ademhalingen voorafgaand aan de stille ademhaling segmenten, na een 30 minuten vertrouwdheid periode. We laten zien dat 10 min stille ademhaling vergelijkbaar is met het gebruik van een veel kortere duur van 15 s. Bovendien kan de tijd die leidt tot deze 15 s stille ademhaling segmenten worden gebruikt om gegevens te verzamelen over apneu van centrale oorsprong. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om patroon-van-ademende gegevens te verzamelen in een bepaalde hoeveelheid tijd en maakt stille basislijnmaatregelen haalbaar voor muizen die verhoogde hoeveelheden prikkelbaar gedrag kunnen vertonen. De UBP-methodologie zelf biedt een nuttige en niet-invasieve manier om patroon-van-ademhaling gegevens te verzamelen en maakt het mogelijk voor muizen worden getest over verschillende tijdspunten.
Introduction
UBP is een veel voorkomende techniek voor de beoordeling van ademhalingspatronen1,2,3,4. Bij deze methode worden muizen in een gesloten kamer geplaatst waar drukverschillen tussen de hoofdkamer (waar het dier is gehuisvest) en een referentiekamer door een pneumotachograaf worden gefilterd om waarden te verkrijgen. De resulterende UBP setup is niet-invasief en ongebreideld en maakt het mogelijk voor ademhalingsmaatregelen worden beoordeeld zonder de eis van anesthesie of chirurgie. Bovendien is deze techniek geschikt voor studies die meerdere metingen in dezelfde muis in de loop van de tijd vereisen. Variabelen zoals ademhalingsfrequentie, getijdenvolume en minutenventilatie kunnen met deze methode worden gekwantificeerd, tijdens een enkele proef of over meerdere proeven. Whole-body UBP biedt ook maatregelen van piekstromen en ademhalingscyclus duur. Samen kwantificeren deze parameters het ademhalingspatroon. De opgenomen ademhalingssporen maken het ook mogelijk om de gegevens te bekijken en het aantal centrale apneu dat binnen een bepaalde periode wordt weergegeven, te tellen. Deze telling kan worden gebruikt naast een analyse van het getijdenvolume en inspiratoire tijden om andere veranderingen in het ademhalingspatroon te meten.
Terwijl verschillende niet-invasieve plethysmografie technieken bestaan voor de directe beoordeling van longfysiologische parameters, hele lichaam UBP zorgt voor een manier om te screenen op de functie van de luchtwegen met minimale onnodige stress aan de muis. Head-out plethysmografie, die gebruik maakt van getijdenmidexpiratoire stroommaatregelen en is ook niet-invasief, is gebaseerd op terughoudendheid, net als vele andere vormen van plethysmografie (bijvoorbeeld, dubbele kamer plethysmografie). Hoewel deze methoden zijn gebruikt in knaagdiermodellen om de responsiviteit van de luchtwegen te meten5,kan het gebruik van halsbanden of kleine bevestigingsbuizen muizen (versus andere soorten) langer duren om te acclimatiseren aan en hun ademhaling terug te brengen naar rustniveaus.
Het verkrijgen van een optimaal luchtademend segment is een belangrijke overweging voor vergelijkingen bij de basislijn. Het toegenomen gebruik van commercieel beschikbare plethysmografiesystemen maakt het verzamelen van gegevens over ademhalingspatronen in veel laboratoria mogelijk. Belangrijk is dat het ademhalingspatroon variabel is gedurende de gehele inzamelingsperiode, met name voor muizen. Met dat gezegd, is het noodzakelijk om basisanalyse te standaardiseren als een middel om ervoor te zorgen dat het opleidingsniveau van onderzoekers de resultaten niet vervormt. Er zijn tal van manieren om een luchtademend segment te verzamelen, dat dient als een gebied van variatie tussen experimentele ontwerpen. Een voorbeeld omvat het gemiddelde van de laatste 10-30 min van gegevens na een eerder gedefinieerde set van tijd in de kamer1, terwijl een andere methode gaat wachten tot de muis zichtbaar kalm is voor 5-10 min6. De laatste kan 2-3 uur duren om te bereiken en in sommige gevallen kan het nodig zijn om een proef te verlaten als de muis niet lang genoeg rustig is. Deze zorg is een bijzonder belangrijke overweging voor stammen van muizen waar waargenomen gedrag angstiger en prikkelbaaris 7. Deze muizen kunnen langer duren om zich aan te passen aan de kamer omgeving en alleen kalm blijven voor korte uitbarstingen van tijd. Het beperken van de tijd die wordt besteed aan basislijnverzameling standaardiseert de kamertijd voor elke muis.
Het is van cruciaal belang dat onderzoekers een geschikte basislijn verkrijgen die waarden van rustgedrag in de muis omvat, maar ook tijdig voorkomt. Daarom is het doel van dit rapport om een beschrijving te geven van methoden die worden gebruikt om korte stille basislijnwaarden voor ademhalingsparameters bij muizen te verkrijgen. Bovendien melden we dat apneu en verhoogde ademhalingen kunnen worden gekwantificeerd tijdens het eerste uur in de kamer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door het Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. Alle dierenwerden gebruikt in overeenstemming met het beleid dat is beschreven in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren8.
OPMERKING: (Kritiek) Voordat u gaat experimenteren, u alle benodigde goedkeuringen en training verkrijgen die nodig zijn voor diergebruik. Het is belangrijk dat de onderzoekers vertrouwd zijn met het gedrag van de muis en activiteitsniveaus, waaronder tekenen van slaap, nood en/of bewegingsartefact versus normale snuiven en ademhaling.
1. Kamer voor het hele lichaam van de barometerplethysmografie
- Lees de juiste gebruikershandleidingen voor de barometerkamer, inclusief connectoren, O-ringen, enz., en maak een standaard protocolbestand om analysers (bijvoorbeeld metabolisch) en parameters die specifiek zijn voor de software te definiëren.
- Zorg ervoor dat alle slangen en buizen zijn aangesloten op de kamer. Sluit een gasstroombuis (flow-in) en een vacuümbuis (flow-out) rechtstreeks aan op de luchtzijde van de pneumagrafiekamer.
LET OP: De instroom moet worden bevestigd aan de opening gemarkeerdbias stroom. - Bevestig CO2,O2en N2 gastanks aan de gasmixer. Zorg ervoor dat alle gastanks zich in de open positie bevinden voordat ze experimenteren.
2. Kalibratie van de Barometrische Plethysmograafkamer
- Kalibreer een hoge en een lage gasstroom door de 7700-versterkersetup te selecteren onder het tabblad Hardware van de barometerhoogleraarsmografiesoftware.
- Stel een vacuüm (stroom uit de kamer) geschikt voor de experimentele ontwerp en gas analyzers (~ 0,1 L/ min).
LET OP: De uitstroomsnelheid moet tijdens de kalibraties gelijk blijven en experimenteren voor nauwkeurige metabolische opnamen. - Stel een lage luchtstroom in door de stroombuis uit de kamer te verwijderen en het vacuüm uit te schakelen.
- Noteer de nulstroom door een 0 in te voeren in de cel met lage eenheid voor de bijbehorende kamer. Dubbelklik op de cel Met lage cal, wijzig de tijd in 3 s en druk op Meten.
- Bevestig de stroombuis opnieuw en laat gas (20,93% O2, gebalanceerde N2)vanuit de gasmixer door de luchtzijde stromen.
- Zet de instroom van liters/minuten om in milliliters/seconde. Klik op de cel van de hoge eenheid voor de overeenkomstige kamer en voer de waarde in milliliters/seconde in. Dubbelklik op Hoog cal,wijzig de tijd in 3 s en klik op Meten.
- Laat het tabblad Setup van de 7700-versterker open om de metabole analysators te kalibreren op de barometertoetsografiesoftware.
3. Metabole Analyzer Kalibratie
- Stel in het gasmixerprogramma de gasmixer in om een gasstroom vrij te geven die 20,93% O2 en 79,07% N2 bevat.
- Stel op de metabole analysators het O2-kalibratieniveau in op 20,93% en de CO2 om 0% te lezen. Draai de wijzerplaat terug naar Voorbeeld zodra de juiste waarden zijn ingevoerd.
- Stel het hoge O2-percentage in. Klik op het tabblad ABCD-4 van de barometertoetssoftware en voer vervolgens 20,93 in onder High Unit van de C2-lijn. Onder High Cal,verander de tijd naar 3 s en druk op Maatregel.
- Stel het lage CO2-percentage in. Voer 0 in onder Laagcal van de C3-lijn en wijzig de tijd in 3 s en klik op Meten onder Laagcal.
- Verander in het gasmixerprogramma de O2-waarde in 10% en de CO2-waarde naar 5%. Wacht enkele minuten tot de gasstroom zich aan deze waarden aanpast. Draai op de metabole analysators de afstelknoppen om CO2 te kalibreren gelijk aan 5%. Zorg ervoor dat u de wijzerplaat terugdraait op Voorbeeld zodra de waarden zijn gekalibreerd.
- Stel het hoge CO2-percentage in. Zorg ervoor dat de analysatormetingen stabiel zijn voordat de juiste waarden in de O2 en CO2 worden ingevoegd op de barometervulgrafiesoftware. Klik op Hoge eenheid onder C3 en voer 5in . Verander High Cal in 3 s en druk op Measure.
- Stel het lage O2-percentage in. Klik op Laag eenheid onder de optie C2 en voer 10in . Klik op Laag Cal,invoer 3 s en klik op Meten.
- Wijzig de gaswaarden op de gasmixer terug naar 20,93% O2 en 79,07% N2. Wacht enkele minuten tot de kamer zich aan deze waarden aanpast. Herhaal de stappen 3.1\u20123.7 als de metabole analysators niet automatisch 20,93% O2 en 0% CO2lezen, om een goede kalibratie te garanderen. Bevestig routinematig de juiste kalibratie met gecertificeerde gastanks.
- Controleer de stroommeters die verbonden zijn met de luchtlithtoragrafiekamer opnieuw. Pas de luchtstroom in en uit de kamer aan op de tarieven die geschikt zijn voor het experiment (meestal 0,1-0,3 L/min).
- Zodra alle instellingen zijn toegepast op de barometerplethysmografiesoftware, klikt u op OK om te beginnen met opnemen.
4. Ongebreidelde barometrische plethysmografie
- Neem het gewicht en de initiële lichaamstemperatuur van de muis vast. Wacht 10 minuten voordat u de muis in de kamer plaatst om O2- en CO2-gegevens uit een lege kamer te verzamelen. Werk in een rustige omgeving die bekend is bij de muizen, zodat lawaai en geuren de gegevensverzameling niet verstoren. Voorkom eventuele verstoringen, waaronder het openen en sluiten van deuren of personeel dat de informatieverzamelingsruimte in/uitbeweegt.
LET OP: Dit specifieke protocol gebruikte 22 maanden oude mannelijke C57BL/6J muis. - Documenteer tijdens het eerste uur het gedrag van de muis en maak gedetailleerde notities, inclusief specifieke waarden van de stroom in/uit de kamer.
- Na 60 min van kamer gewenning, kijk voor segmenten van stille ademhaling voor de volgende 60 min. Lijst van segmenten die ten minste 15 s in lengte zonder snuiven en verzorgen. Neem lichaamstemperatuur maatregelen om de 10 min bij het gebruik van een implanteerbaar apparaat.
- Verwijder aan het einde van het experiment de muis uit de kamer en plaats deze terug in zijn kooi. Alle apparatuur moet grondig worden gereinigd en afgeveegd. Als er druppels water achterblijven, gebruik dan onder druk staande lucht om ze te verwijderen.
5. Analyse van het patroon van ademhaling en metabolisme
- Open het barometerbestand van de plethysmografie en raadpleeg de opgenomen notities voor het dier van belang.
- Open het metabole paneel in de software en neem het gemiddelde van de eerste 10 min van O2 en CO2, wanneer de kamer leeg was. Noteer deze waarden als de FiO2 en FiCO2.
- Bekijk het deelvenster Flow van de barometerhoogleraarsografiesoftware. Klik met de rechtermuisknop op Kenmerken analyseren en stel de juiste parameters in. Voer onder het tabblad Meta 1 de FiO2 en FiCO2 in vanaf stap 5.2, evenals de stroom in de kamer onder Meta 2, om VO2 en VCO2te berekenen .
- Voor patroon van ademhalingsanalyse, bevestig de tijden voor de 15 seconden van stille ademhaling gebruikend nota's over dierlijk gedrag evenals het traceren van het stroompaneel. Voer de tijden in voor de intervallen van 15 s van stille ademhaling onder Open Data Parser Dialogue van het tabblad Gegevensparser. Klik op Parser View Mode om alleen de specifieke 15-segmenten van belang weer te geven.
- Klik op Afgeleide gegevens opslaan. Open het gegevensbestand in een spreadsheet om de opgeslagen gegevens te verkrijgen.
6. Analyse van Apneu en augmented breaths
- Sluit in het open controlebestand de modus Parser View af. Ga naar de optie Grafiekinstelling onder Setup > P3-instelling en selecteer Paginaweergave onder Type. Selecteer 5 voor het aantal deelvensters. Voer -2 in de doos met het label Laag en 2 in de doos met het label Hoog voor stroommetingen in milliliters per seconde. Pas de wijzigingen toe.
- Schuif naar de markering van 30 min op het deelvenster doorstoring.
- Tel apneu en verhoogde ademhalingen voor de 30-60 min nadat de muis werd geplaatst in de kamer. Kwantificeren perioden van zwevende ademhaling die langer duren dan of gelijk zijn aan 0,5 s, indicatief voor een apneu. Verhoogde ademhalingen worden aangegeven door een sterke stijging van het ademhalingsspoor boven 1,25 mL/s, gevolgd door een scherpe daling onder -0,75 mL/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van UBP als een evaluatie van het patroon van de ademhaling in 16 oude (22 maanden oude) muizen uitgevoerd onder normaal luchtgas (20,93% O2 met evenwichtige N2) worden gemeld. De analyse omvatte eerst een vergelijking van een langer 10 min quiet breathing segment (dat meer dan 2 uur duurde om te verkrijgen) met het gemiddelde van vier korte 15-segmenten (gekwantificeerd binnen minuten 60–120). Een representatieve flow tracing van stille ademhaling, waarbij de ademhaling consistent is met geen actief ademhalingsgedrag, is opgenomen in figuur 1A. Wanneer soortgelijke traceringen van dieren worden verzameld, moet 100% van de ademhalingen door de software worden geaccepteerd. Figuur 1B staat echter voor ademhaling uit een actiever segment, waar de muizen de kamer verkennen, snuiven en/of verzorgen. Tracerings zoals die in figuur 1B zijn minder waarschijnlijk worden aanvaard door de software en zijn niet ideaal voor het type van de ademhaling collectie gebruikt en uitgelegd door deze methode. De parameters die werden geselecteerd voor de beoordeling van mogelijke ademhalingsverschillen tussen de twee tijdpunten waren ademhalingsfrequentie (figuur 2A), getijdenvolume (VT, Figuur 2B), minieme ventilatie (VE, Figuur 2C),getijdenvolume/inspiratoire tijdsverhouding (VT/Ti, figuur 2D)en minieme ventilatie/verdreven kooldioxideverhouding (VE/VCO2/g, figuur 2E),die allemaal werden berekend met behulp van de barometerplethysmografiesoftware en Drorbaugh en Fenn-vergelijking. De waarden die voor deze metingen worden gerapporteerd, liggen binnen het bereik van wat we eerder hebben gerapporteerd voor het muismodel6,9. Er werden geen significante verschillen tussen groepen opgehelderd; post-hoccorrecties voor meerdere vergelijkingen van ademhalingsfrequentie en VT-gegevens werden verantwoord met Bonferroni(p < 0,025 werd als significant beschouwd). Uit deze resultaten blijkt dat het gebruik van een vereenvoudigd protocol met basislijnen van 15 jaar vergelijkbare resultaten oplevert als een langer basislijnprotocol.
Verdere analyse werd uitgevoerd met elk van de vier 15 s baseline segmenten voor frequentie, VT, VE, VT/ Ti, en VE / VCO2/ g (Figuur 3). Er zijn geen significante verschillen(p > 0,05) gevonden tussen een van de tijdpunten. Er waren ook geen verschillen in de variabiliteit tussen een van de vier tijdsegmenten voor een patroon-van-ademhaling maatregel. Daarnaast hebben we de variabiliteit van het segment van de 15 s-groep versus de 10 min groep getest en vonden we geen significante verschillen met behulp van Levene's test bij het vergelijken van de gemiddelde groepsgegevens.
Het aantal apneu en verhoogde ademhalingen die voor elk dier worden waargenomen tijdens minuten 30-60 van het UBP-protocol worden gepresenteerd in figuur 4. Uit deze resultaten blijkt dat oudere dieren een groot aantal apneu en de aanwezigheid van verhoogde ademhalingen binnen een periode van 30 minuten vertonen (tracering in figuur 1C). De gegevens zijn indicatief voor veranderingen tijdens het verouderingsproces, omdat deze bevindingen werden waargenomen bij 22 maanden oude muizen. Om de interrater betrouwbaarheid voor apneu en augmented breath analyses te bevestigen, werd Pearson correlatie berekend voor twee verschillende onderzoekers. Er werd een hoge mate van overeenstemming tussen beoordelaars gevonden, zoals aangegeven door een waarde van r = .99 voor apneu en r = .86 voor verhoogde ademhalingen. In toekomstige studies, een verhoogd aantal apneu in vergelijking met een controlegroep zou vertellen van een ademhalingsstoornis als gevolg van een neurale component.
Figuur 1: Representatieve stroomtraceringen. (A) Stroomtracering vanaf een stille basislijn, waarbij de muis geen actief gedrag zoals snuiven of grooming laat zien. (B) Flow tracing uit een actieve ademperiode niet opgenomen in onze analyses, waar muizen bewegen over de kamer en veel ademhalingen worden niet routinematig geaccepteerd. (C) Flow tracing met een verhoogde adem, gevolgd door een periode van apneu. Voor alle sporen wordt een 5-s venster getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Ademhalingsparameters zijn vergelijkbaar voor rustige ademhalingssegmenten van 10 min en 15 s bij 22 maanden oude muizen. Barometrische plethysmografie werd gebruikt om ademhalingsgegevens te verzamelen bij oude muizen(n = 16, 22 maanden oud). Ademhalingsgegevens werden berekend voor muizen gedurende twee verschillende tijdstippen, namelijk het gemiddelde van vier 15 s kalme intervallen binnen de 60-120 min teken van de muis in de kamer en voor 10 min van consistente kalme ademhaling. (A) Ademhalingsfrequentie (ademhalingen/minuut). bB) Getijdenvolume (VT; milliliter/adem). (C) Minutenventilatie (VE; milliliter/minuut). (D) Verhouding van getijdenvolume tot inspiratietijd (VT/Ti; milliliter/seconde). (E) Verhouding van de minieme ventilatie tot de uitgestoten kooldioxide, genormaliseerd tot gewicht (VE/VCO2/g). Er zijn geen statistisch significante verschillen tussen de groepen na post hoc correcties(p > 0,025). Waarden van >3 SD boven het gemiddelde werden beschouwd als uitschieters en verwijderd uit de gegevensset. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van vier intervallen van 15 s. Ademhalingsgegevens werden berekend in kalme ademhalingsmuizen(n = 16, 22 maanden oud) voor vier afzonderlijke intervallen van 15 s binnen de 60-120 min van kamerplaatsing. (A) Ademhalingsfrequentie (ademhalingen/minuut). bB) Getijdenvolume (VT; milliliter/adem). (C) Minutenventilatie (VE; milliliter/minuut). (D) Verhouding van getijdenvolume tot inspiratietijd (VT/Ti; milliliter/seconde). (E) Verhouding van de minieme ventilatie tot de uitgestoten kooldioxide, genormaliseerd tot gewicht (VE/VCO2/g). Er zijn geen statistisch significante verschillen tussen de tijdsegmenten(p > 0,05). Uitschieters worden gedefinieerd als >3 SD boven het gemiddelde en verwijderd. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Apneu en verhoogde adem telt bij muizen. Apneu (≥0,5 s zonder ademhaling) en verhoogde ademhalingen (AB's; een sterke toename van inademing meer dan 1,25 mL/s gevolgd door een scherpe uitademing onder -0,75 mL/s) werden geteld bij oude muizen(n = 16, 22 maanden oud) tussen 30-60 min. De tellingen werden geanalyseerd over 30 min en het totaal voor die periode worden gemeld. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Schematisch van de ongebreidelde barometerhoogleraare plethysmografie (UBP) setup. De algemene UBP setup moet vergelijkbaar zijn met die beschreven in de figuur. Stroommetingen moeten worden gemeten voor de gassen die de kamer binnenkomen en verlaten, en de gassamenstelling moet bekend staan om gegevensinterpretatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol biedt informatie over een stille ademhaling baseline bij muizen, evenals het verzamelen van gegevens over centrale apneu en verhoogde ademhalingen. De representatieve resultaten tonen aan dat een 10 min stille baseline een vergelijkbaar patroon van ademhaling heeft in vergelijking met een gemiddelde van vier 15 s aanvallen voor een cohort van oude muizen. Belangrijk is dat de 15 s aanvallen zijn niet statistisch verschillend, noch hebben deze groepen verschillen in variatie van elkaar met behulp van Levene's test. Deze gegevens tonen aan dat zelfs een korte aanval is voldoende voor het toezicht op de stille ademhaling. Echter, het is heel goed mogelijk dat het analyseren van individuele variatie binnen een muis op 15 s vs. 10 min kan resulteren in verschillende bevindingen, als de 10 min bout zou kunnen omvatten minimale snuiven en grooming activiteiten. Het gebruik van Levene's test voor een vergelijking van afzonderlijke muisbasislijnsegmenten biedt echter een andere analyse dan die in dit protocol wordt beschreven. Globaal, gebruikt het ontwerp van deze methodologie 15 ademhalingssegmenten die tijdens minuten 60-120 in de kamer kunnen worden verworven, versus het moeten wachten op elke muis om langere duur van stille basislijn te bereiken.
De kortere duur die nodig is voor baseline zorgt voor meer angstige / geagiteerde stammen van muizen worden getest op stille ademhaling. Het gebruik van een langer ademhalingssegment (d.w.z. 10 of 2 min) verlengt de protocolduur, tot een punt waarop een proef mogelijk moet worden gestaakt als de muizen niet binnen 3 uur een stille ademhaling vertonen. Aangezien veel experimentele ontwerpen ook ademhalingsproblemen bevatten (d.w.z. hypoxie), benadrukt de langere tijd die voor andere gassen is toegewezen, de noodzaak om de inzameltijd van de basislijn te standaardiseren. Het gebruik van een enkele 15 s bout van stille ademhaling helpt om de bezorgdheid van het werken met muizen (en stammen van muizen) die bijzonder prikkelbaar in de kamer kunnen verlichten verlichten. Tijdens het werken met barometrische plethysmografie, vonden we dat ~ 10% van de muizen per studie moest worden uitgesloten vanwege hun onvermogen om zo weinig als 2 min van continue stille ademhaling in de kamer uit te voeren. De uitvoering van eerdere kennismakingsproeven slaagde er niet in om muizen sneller te laten kalmeren wanneer ze op de dag van experimenteren in de kamer werden geplaatst. Echter, omdat verschillende stammen, geslachten en leeftijden van muizen allemaal anders kunnen reageren op de kameromgeving10,11,is het mogelijk dat gewenningstechnieken nuttig kunnen zijn12,13 voor sommige cohorten. Onze kennismakingsproeven bestonden uit het plaatsen van de muizen in de UBP kamer in de testkamer voor 1-2 uur voor enkele dagen voorafgaand aan experimenten. Hoewel we geen veranderingen in dierlijk gedrag waarnamen na deze procedure, heeft een eerdere studie aangetoond dat 24 uur gewenning nodig was om nieuwe effecten te elimineren die resulteerden in spontane fysieke activiteit bij muizen12. Bovendien, Kabir et al. vond dat het plaatsen van plastic cilinders vergelijkbaar in grootte aan de barometerplethysmografie kamer in de kooi thuis was voordelig in het verkrijgen van ratten om zich vertrouwd te maken met de opstellingen voorafgaand aan experimenten13.
Dit protocol onthult ook mogelijke ademhalingsstoornissen bij muizen via de kwantificering van centrale apneu, indicatief voor neurale controleproblemen. Dertig minuten observatie voorafgaand aan de basislijn patroon-van-ademhaling collectie bleek dat alle 16 oude muizen weergegeven een hoog aantal apneu episodes en verhoogde ademhalingen (vertegenwoordigd in figuur 1C). De talrijke apneu in dit oude muizencohort benadrukken het vermogen van dit protocol om een andere belangrijke ademhalingsmaatregel te kwantificeren zonder extra tijd toe te voegen aan experimenten. Opgemerkt moet worden dat leeftijd en ziekteprogressie (indien van toepassing) de aanwezigheid en het aantal apneuepisodes kunnen beïnvloeden.
Om stille ademhaling te karakteriseren, is het belangrijk om de luchtstilisme kamer en muis gedurende de duur van het protocol voortdurend te observeren. Voor de kwantificering van stille ademhaling moeten muizen wakker zijn, maar niet deelnemen aan actief gedrag zoals snuiven, verzorgen of verkennen (weergegeven in figuur 1A). Aangezien de patronen van ademhaling tijdens de slaap kunnen verschillen van die in een wakker dier14,15, is de verzameling van kalme ademhaling tijdens de wakkere toestand van cruciaal belang. Het is mogelijk dat langere segmenten van stille ademhaling perioden van slaap kunnen omvatten, die niet gewenst zijn, afhankelijk van het experimentele ontwerp. In dit geval zou kortere segmenten van stille ademhaling ideaal zijn om te documenteren, omdat de kans op het verzamelen van gegevens tijdens de slaap wordt verminderd wanneer actieve segmenten de korte (15 s) stille ademhalingssegmenten flankeren. We hebben opgemerkt dat langere segmenten van stille ademhaling een uitdaging kunnen zijn om te verwerven in het muismodel, omdat muisgedrag in de kamer heel anders lijkt te zijn dan dat van ratten. Het is belangrijk om de ademhalingsstroom van de muis kritisch te observeren voor geschikte ademhalingssegmenten en om dierlijk gedrag vast te leggen. In geval van verminderde ventilatie of instabiele ademhaling kan deze methode nog steeds worden gebruikt. In deze gevallen is het essentieel dat de experimentator wordt verblind door het cohort bij het selecteren van de segmenten van 15 s. Het softwareprogramma moet de ademhalingen onderscheiden, met een acceptatiepercentage van 100% tijdens de periode van 15 s. We raden u aan kennis te nemen van de ademhalingstraceringen, naast het feit dat de dieren voldoen aan de gedragscriteria voor baseline, omdat het mogelijk is dat stilstaande muizen nog steeds angstig zijn. Een eerdere studie meldde dat, hoewel ratten kalm gedrag vertoonden, ze nog steeds veranderde ademhalingspatronen vertoonden (d.w.z. verhoogde frequentie) in reactie op gecontroleerde stimuli in de testruimte13.
Frequentiemetingen, VT, VE, inspiratory en expiratoire tijd, en VE/VCO2 worden allemaal gekwantificeerd met behulp van analyzers en de UBP-software en worden vaak gerapporteerd in de literatuur. In het bijzonder, VT en VE berekeningen gebruik maken van de Drorbaugh en Fenn vergelijking16, die bekende waarden voor lichaamstemperatuur, omgevingskamer temperatuur, vochtigheid, en barometerdruk vereist. Het wordt aanbevolen om deze maatregelen gedurende het hele experiment te verzamelen voor de meest nauwkeurige VT- en VE-waarden. Andere variabelen die door het systeem worden berekend, moeten met de nodige voorzichtigheid worden gebruikt. UBP is geen directe maat van longmechanica; variabelen met betrekking tot luchtwegweerstand (bijvoorbeeld verbeterde pauze [Penh]) moeten dus worden geïnterpreteerd met dit voorbehoud in gedachten5. Aanvullende componenten van de UBP-installatie die van invloed kunnen zijn op variabelen die door de software worden berekend, zijn debietsnelheden en de algemene kalibratie van het systeem. Bevestig dat afdichtingen en pakkingen naar behoren werken (geen lekken) en zorg voor een goede aansluiting van alle apparatuur op de luchtdrukkamer (Figuur 5). De stroomsnelheden in en uit de kamer moeten consistent worden gehouden. Vereiste stroomsnelheden kunnen verschillen tussen UBP-instellingen, dus het is belangrijk om deze waarden te controleren voordat u experimenteert. De stroomsnelheid in de kamer moet voldoende zijn om verse lucht of gas uitdagingen te bieden in een tijdige wijze. De stroomsnelheid moet ook voldoende zijn om de metabole analysators in staat te stellen O2 en CO2 te meten zonder DAT CO2 zich opbouwt in de kameromgeving, wat het risico van een veranderend ademhalingspatroon inhoudt. Op dezelfde manier moeten gasmixer/analyzer kalibraties regelmatig worden geïmplementeerd om ervoor te zorgen dat de metabolische parameters nauwkeurig worden gemeten.
Andere overwegingen voor bewuste UBP zijn het verminderen van afleiding in de experimentele ruimte, terwijl dieren worden getest. Luide geluiden, verschillende geuren, en de aanwezigheid van niet-essentieel personeel in de kamer kan allemaal toevoegen aan angstig gedrag tentoongesteld door muizen. Het gebruik van kleinere ruimtes als testgebieden kan helpen, maar als dit niet mogelijk is, kunnen kartonnen wanden (met een klein kijkvenster) rondom de kamer worden opgezet om afleiding voor de muizen te verminderen. Elektrische activiteit in de ruimte moet tot een minimum worden beperkt om extra ruis binnen de barometerplethysmografie-tracering te voorkomen. Daarom is het belangrijk om kennis te nemen van de flow tracings tijdens de periode van 10 min wanneer de software gegevens verzamelt uit een lege kamer. Deze traceringen moeten vlak blijven, en eventuele onderbrekingen of lichte golven zijn tekenen van lawaai en moeten worden aangepakt. Drukveranderingen van het openen en sluiten van deuren of van HVAC-werking kunnen ook leiden tot foutieve schommelingen en ervoor zorgen dat deze acties minimaal plaatsvinden (en ze opmerken wanneer ze zich voordoen) is van cruciaal belang. Vochtigheid kan ook invloed hebben op het berekende getijdenvolume en de minieme ventilatie, waardoor het erg belangrijk is om te bevestigen dat de kamer en verbindingsbuizen voor gebruik worden gedroogd. Indien nodig kan het gebruik van Drierite kralen in volgorde met de instroombuizen helpen alle condensatie in de lucht te verwijderen voorafgaand aan de kameringang. Deze stap zou worden ingesteld in gevallen waarin de luchtvochtigheid routinematig hoger is geweest dan de niveaus die zijn vermeld in The Guide for the Care and Use of Animals8 (30%-70%, idealiter binnen 10% van het setpoint). Vochtigheid kan zich ook in de kamer ophopen door de aanwezigheid van het dier. Hoewel sommige vochtigheid normaal is, kan het blijven bouwen als het dier overmatig actief is of voor langere tijd in de kamer wordt geplaatst. Als de luchtvochtigheid de maximale niveaus (99,99%) bereikt, moet de kamer mogelijk tijdens experimenten worden geopend en afgeveegd om vergelijkbare ademhalingsmaatregelen te handhaven. De software is verantwoordelijk voor veranderingen in de luchtdruk, omgevingstemperatuur, temperatuur van dieren en vochtigheid. Beste praktijk is om de waarden te handhaven binnen een redelijk bereik, zodat "appels met appels" worden vergeleken tussen leeftijden, stammen en geslachten. Bovendien zijn de circadiane cyclus van muizen en het tijdsbereik van het testen, evenals specifieke lichtomstandigheden van de kamer, belangrijke details om13,17te overwegen . We testen muizen bijvoorbeeld meestal in verlichting die vergelijkbaar is met hun kamer (lichte of donkere cyclus) en binnen een bereik van 3 uur18. Onderzoekers moeten ook blind blijven voor de diergroepen tijdens het verzamelen van gegevens en analyses om verschillen in de selectie van een basislijn te voorkomen. Indien mogelijk moet dezelfde experimentator alle gegevens verzamelen en/of alle traceringen in een bepaald experiment analyseren. Stappen om onderzoekers verblind te houden voor de diergroepen, evenals randomisatie en testen tijdens vergelijkbare tijden van de dag, zijn cruciaal voor de strengheid van het onderzoek. Uiteindelijk zijn er externe factoren die de flow tracings kunnen veranderen, en deze zorgen moeten worden overwogen bij het uitvoeren van UBP.
De UBP-methode is een techniek die wordt gebruikt om het patroon van het inademen van muizen te karakteriseren. Baseline maatregelen kunnen worden verzameld binnen 2 uur bij het gebruik van een 15 s ademhaling segment. Hier melden we een methode die kan worden uitgevoerd met oude muizen, die vaak meer geagiteerd in de kamer dan jongere muizen, wat suggereert dat andere angstige of actieve muisstammen kunnen ook worden getest met dit protocol. De gegevens verzameld van UBP is niet-invasieve en maakt het mogelijk voor het testen over meerdere tijdpunten, die nuttig is voor studies over veroudering, medicamenteuze therapie, en progressie van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Angela Le, Sarah Ruby en Marisa Mickey bedanken voor hun werk voor het behoud van de dierenkolonies. Dit werk werd gefinancierd door 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. ter ondersteuning van CNR) en de McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
