Summary
非拘束的な気圧胸膜造影は、目覚めたマウスの呼吸パターンを定量化するために使用される。標準化されたプロトコルの下の15のセグメントは、静かな呼吸の延長持続時間と同様の値を表示することを示しています。この方法論はまた、チャンバーの最初の1時間の間に無呼吸および拡張呼吸の定量化を可能にする。
Abstract
非拘束気圧プレチスモグラフィー(UBP)は、呼吸頻度、潮量、および微小換気が日常的に報告されているマウスの呼吸パターンを定量化する方法である。さらに、中央無呼吸や拡張呼吸の存在を含む呼吸の神経出力に関する情報を収集することができます。UBPにとって重要な考慮事項は、呼吸困難への対応を解明するために、不安な行動や活動的な行動の影響を最小限に抑えた呼吸セグメントを得ることだ。ここでは、静かな呼吸のより長い発作を待つことに匹敵する、老化したマウスで短く静かなベースラインを得ることを可能にするプロトコルを提示する。マウスの一部の株がますます興奮または不安であり、静かな呼吸のより長い期間が合理的な時間枠内に達成されない可能性があるため、より短い時間セグメントの使用は貴重です。生後22か月のマウスをUBPチャンバーに配置し、60~120分の間の静かな呼吸セグメントを、獲得までに2〜3時間かかった10分の静かな呼吸期間と比較しました。また、静かな呼吸セグメントの前に、30分の慣れ親しんだ期間に続いて、中央無呼吸と拡張呼吸の数を得ました。静かな呼吸の10分は、はるかに短い15の持続時間を使用することに匹敵することを示しています。さらに、これらの15の静かな呼吸セグメントに至るまでの時間は、中央起源の無呼吸に関するデータを収集するために使用することができます。このプロトコルは、研究者が一定の時間で呼吸パターンデータを収集することを可能にし、興奮性行動の増加量を示す可能性のあるマウスに対して静かなベースライン対策を実現可能にする。UBPの方法論自体は、呼吸パターンデータを収集するための有用かつ非侵襲的な方法を提供し、マウスをいくつかの時間ポイントにわたってテストすることを可能にする。
Introduction
UBP は、呼吸パターン1、2、3,、4の評価に共通する手法です。,この方法では、マウスは、メインチャンバー(動物が収容されている場所)と参照チャンバーの間の圧力差が気胸管を通して濾過されて値を得る閉じたチャンバーに配置される。結果として生じるUBPのセットアップは非侵襲的で拘束されず、麻酔または外科の必要性なしで呼吸の処置を査定することを可能にする。さらに、この手法は、同じマウスでの複数の測定を必要とする研究に適しています。呼吸頻度、潮量、微小換気などの変数は、単一の試行中またはいくつかの試行の間に、この方法で定量化することができます。全身UBPはまたピーク流れおよび呼吸周期の持続時間の測定を提供する。これらのパラメータは、一緒に呼吸のパターンを定量化します。記録された呼吸痕はまたデータを確認し、一定期間内に表示される中央無呼吸の数を数えることを可能にする。このカウントは、呼吸のパターンにおける他の変化を測定するために、潮量および吸気時間の分析と一緒に使用することができる。
肺生理学的パラメータの直接評価のためにいくつかの非侵襲的なプレチスモグラフィー技術が存在するが、全身UBPは、マウスへの最小限の過度のストレスで呼吸機能をスクリーニングする方法を可能にする。逆流性流れ対策を利用し、非侵襲的でもあるヘッドアウトプレチスモグラフィーは、他の多くのタイプのプレチスモグラフィー(例えば、二重房胸膜造影)と同様に拘束に依存する。これらの方法は、気道応答性5を測定するためにげっ歯類モデルで使用されているが、首輪または小さな拘束チューブの使用は、マウス(対他の種)を慣れて休息レベルに呼吸を戻すために長くかかる可能性がある。
最適な空気呼吸セグメントを得ることは、ベースライン比較の重要な考慮事項です。市販のプレチスモグラフィーシステムの使用が増加し、多くの研究室で呼吸パターンデータの収集が可能になります。重要なことに、呼吸パターンは、特にマウスの採取期間を通して可変である。そうは言うが、実験者の訓練レベルが結果を混乱させないようにする手段として、ベースライン分析を標準化する必要がある。空気呼吸セグメントを収集する方法は数多くあり、実験計画間の変動の1つの領域として機能します。1 つの例としては、チャンバー1内で事前に定義された時間のセットに従って、最後の 10 ~ 30 分のデータを平均化する方法が含まれます。後者は、達成するために2〜3時間かかることがあり、場合によっては、マウスが十分に長く落ち着いていない場合、試練を放棄する必要があるかもしれません。この懸念は、観察された行動がより不安で興奮性の高いマウスの株に対する特に重要な考慮事項である7。これらのマウスは、チャンバー環境に適応するのに時間がかかり、短い時間のバーストのためにのみ落ち着いている可能性があります。ベースライン収集に費やす時間を制限することで、各マウスのチャンバー時間を標準化します。
実験者は、マウスの安静時の動作値を包含する適切なベースラインを取得するが、タイムリーに発生することも重要です。したがって、このレポートの目的は、マウスの呼吸パラメータの短い静かなベースライン値を取得するために使用される方法の説明を提供することです。さらに、無呼吸と拡張呼吸は、チャンバーの最初の1時間の間に定量化することができることを報告する。
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Protocol
すべての手続きは、ル・モイン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。動物の使用はすべて、実験動物のケアと使用ガイドに記載されているポリシーに同意していました。
注:(クリティカル)実験の前に、動物の使用に必要なすべての承認と訓練を受けます。実験者は、睡眠、苦痛、および/または運動アーティファクトの兆候と通常のスニッフィングと呼吸の兆候を含むマウスの行動と活動レベルに精通していることが重要です。
1. 全身気圧プレチスモグラフィーチャンバー
- コネクタ、Oリングなどの気圧プレチスモグラフィーチャンバの適切なユーザーマニュアルを読み、ソフトウェアに固有のアナライザー(例えば、代謝)およびパラメータを定義するための標準プロトコルファイルを作成します。
- すべてのホースとチューブがチャンバーに接続されていることを確認してください。気体流管(フローイン)と真空管(フローアウト)を気圧プレチスモグラフィーチャンバーに直接接続します。
注:流入フローは、開始マークされたバイアスフローにアタッチする必要があります。 - CO2、O2、N2ガス2タンクをガスミキサーに取り付けます。2実験前に、すべてのガスタンクがオープン位置に位置していることを確認してください。
2. バロメトリックプレチスモグラフチャンバーの較正
- 気圧プレチスモグラフィソフトウェアの[ハードウェア]タブで7700-アンプの設定を選択して、高いガスと低い流量を較正します。
- 実験設計およびガス分析装置(約0.1 L/分)に適した真空(チャンバーから流れる)を設定します。
注:アウトフローレートは、正確な代謝記録のためのキャリブレーションと実験を通じて同じままでなければなりません。 - チャンバーから流れ管を取り外し、真空をオフにして空気の低流量を設定します。
- 対応するチャンバのローユニットセルに0を入力してゼロフローを記録します。[低カロリー ]セルをダブルクリックし、時間を 3 s に変更して、[メジャー]を押します。
- フローチューブを再取り付けし、ガスミキサーから気圧プレ2チスモグラフィーチャンバーを通ってガス(20.93%O2、バランスN2)を流れるようにします。
- 流入量をリットル/分からミリリットル/秒に変換します。対応するチャンバの[高い単位]セルをクリックし、ミリリットル/秒単位で値を入力します。[高]をダブルクリックし、時間を 3 s に変更して、[計測] をクリックします。
- 7700-アンプの設定タブを開いたままにして、代謝分析装置を気圧的プレチスモグラフィーソフトウェアにキャリブレーションします。
3. 代謝分析装置のキャリブレーション
- ガスミキサープログラムでは、ガスミキサーを20.93%O2および79.07%N2を含むガスの流れを放出するように設定する。2
- 代謝分析計で、O2キャリブレーションレベルを20.93%に、CO2を0%に設定します。適切な値を入力したら、ダイヤルを[サンプル] に戻します。
- 高いO2パーセンテージを設定します。気圧プレチスモグラフィーソフトウェアのABCD-4タブをクリックし、C2ラインの高単位の下に20.93と入力します。[高いカル] で、時間を 3 s に変更し、[メジャー]を押します。
- 低 CO2の割合を設定します。C3 ラインの[低カロリー ] の下に0と入力し、時間を 3 s に変更し、[低カロリー] の [メジャー ] をクリックします。
- ガスミキサープログラムで、O2値を10%に、CO2値を5%に変更します。ガスの流れがこれらの値に合わせるまで、数分間待ちます。代謝分析計で、調整ノブを回してCO2を5%に調整します。値が調整されたら、必ずダイヤルを[サンプル]に戻してください。
- 高い CO2の割合を設定します。気圧プレチスモグラフィーソフトウェアのO2とCO2に適切な2値を挿入する前に、アナライザの測定値が安定していることを確認してください。C3 の下の[高い単位]をクリックし、「5」と入力します。高いカルを3 sに変更し、メジャーを押します。
- 低いO2パーセントを設定します。C2 オプションの下の[低単位]をクリックし、「10」と入力します。[低カロリー] をクリックし、入力 3 s をクリックし、[メジャー] をクリックします。
- ガスミキサーのガス値を20.93%O2と79.07%N2に戻2します。チャンバーがこれらの値に調整されるまで数分待ちます。正しいキャリブレーションを行うために、代謝分析計が自動的に20.93%O2と0%CO2を読み取らない場合は、手順23.1\u20123.7を繰り返します。認定ガスタンクで適切な校正を定期的に確認します。
- 気圧プレチスモグラフィーチャンバに接続されている流量計を再確認します。チャンバの出入りする空気の流れを調整して、実験に適した速度(通常は0.1~0.3 L/min)します。
- すべての設定が気圧プレチスモグラフィソフトウェアに適用されたら、[OK]をクリックして録音を開始します。
4. 拘束されていない圧膜プレチスモグラフィー
- マウスの体重と初期体温を記録します。マウスをチャンバーに入れる前に10分待ち、空のチャンバーからO2およびCO2データを収集する。マウスになじみのある静かな場所で作業するので、ノイズや匂いがデータ収集を妨げないようにします。ドアの開閉や、データ収集室の出入りなど、あらゆる混乱を避けてください。
注:この特定のプロトコルは、22ヶ月齢の雄C57BL / 6Jマウスを採用しました。 - 最初の1時間の間に、マウスの挙動を文書化し、チャンバーの流入/流出流れの特定の値を含む詳細なメモを取ります。
- チャンバーの習慣の60分後、次の60分間静かな呼吸のセグメントを見てください。埋め込み式の装置を使用する場合は、10分ごとに体温測定を行ってください。
- 実験の最後に、チャンバーからマウスを取り出し、ケージに戻します。すべての機器は、完全に洗浄し、拭き取る必要があります。水滴が残っている場合は、加圧空気を使用してそれらを除去します。
5. 呼吸と代謝のパターン解析
- 気圧プレチスモグラフィーレビューファイルを開き、関心のある動物のために記録されたノートを参照してください。
- ソフトウェアで代謝パネルを開き、チャンバーが空だったときにO2とCO2の最初の210分の平均を取ります。これらの値を FiO2および FiCO2として記録します。
- 気圧プレチスモグラフィソフトウェアのフローパネルを表示します。[属性の分析]を右クリックし、適切なパラメータを設定します。Meta 1タブで、ステップ 5.2 の FiO 2 と FiCO2と、メタ2の下のチャンバへの流れを入力して VO 2 と VCO2を計算します。2
- 呼吸パターン解析では、動物の行動やフローパネルのトレースに関するメモを使用して、静かな呼吸の15秒間の時間を確認します。[データ パーサー ] タブの [データ パーサー ダイアログを開く]の下で、静かな呼吸の 15 の間隔の時間を入力します。
- [解析された派生データの保存] をクリックします。スプレッドシートでデータ ファイルを開き、ビン分割されたデータを取得します。
6. 無呼吸と拡張呼吸の分析
- 開いているレビュー ファイルで、パーサー表示モード を終了します。[設定]-[P3Setup設定] の下にある[グラフの設定] オプションに移動し、[種類]の下の[ページビュー ] を選択します。ペインの数として5を選択します。フローメジャーの場合は「低」とラベル付けされたボックスに-2、ミリリットル/秒の流量の場合は「高」とラベル付けされたボックスに「2」と入力します。変更を適用します。
- フロートレーシングパネルの30分のマークまでスクロールします。
- マウスがチャンバーに置かれた後、30〜60分間の無呼吸と拡張呼吸を数えます。無呼吸を示す0.5s以上続く中断呼吸の期間を定量化する。拡張呼吸は、1.25 mL/sを超える呼吸痕跡の急激な上昇に続いて、-0.75 mL/sを下回る急激な減少によって示されます。
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Representative Results
正常な空気ガス下で行われる16歳(22ヶ月齢)マウス(20.93%O2とバランスN2)における呼吸パターンの評価2としてのUBPの結果が報告されている。分析には、最初に、より長い10分静かな呼吸セグメント(得るのに2時間以上かかった)と4つの短い15 sセグメントの平均(60〜120分以内に定量化)の比較が含まれていました。呼吸がアクティブな呼吸行動と一致しない静かな呼吸の代表的な流れのトレースは図1Aに示されている。動物から同様のトレースが収集される場合、呼吸の100%はソフトウェアによって受け入れられるべきです。しかし、図1Bは、マウスがチャンバーを探索したり、スニッフィングしたり、グルーミングしたりする、よりアクティブなセグメントからの呼吸を表しています。図 1Bに示すようなトレースは、ソフトウェアで受け入れられる可能性が低く、この方法論で使用され説明される呼吸収集の種類には適していません。2つの時点間の呼吸パターンの違いの評価のために選択されたパラメータは、呼吸周波数(図2A)、潮汐量(VT、図2B)、微小換気(VE、図2C)、C潮流/吸気時間比(VT/Ti、図2D)、および微小換気/排出二酸化炭素比(VE/VCO2/g、図2E)は、すべて気圧プレチスモグラフィーソフトウェアとDrorbaughとFenn方程式を使用して計算した。これらのメジャーについて報告される値は、マウス モデル6、,9に対して以前に報告した値の範囲内です。グループ間で有意な違いは明らかにされなかった。呼吸周波数とVTデータの複数比較のためのポストホック補正は、ボンフェローニとの考慮された(p < 0.025は有意であると考えられた)。これらの結果は、15 s ベースラインを使用して簡略化されたプロトコルを使用すると、より長いベースライン プロトコルのそれと同様の結果を提供することを示しています。
周波数、VT、VE、VT/Ti、およびVE/VCO2/gの4つの15 sベースラインセグメントのそれぞれについて、さらに分析を行った(図3)。どの時点間でも有意な差(p > 0.05) は見つかりませんでした。また、呼吸パターン測定の4つの時間セグメントの間の変動性にも違いはありませんでした。さらに、15 sグループと10分のグループのセグメントのばらつきをテストし、平均されたグループデータを比較する際にLeveneの検定を使用して有意差は見つからなかった。
UBP プロトコルの分 30 ~ 60 分の間に各動物に対して観察された無呼吸と拡張呼吸の数を図 4に示します。これらの結果は、老化した動物が30分以内に多数の無呼吸および拡張呼吸の存在を示していることを示している(図1Cに示すトレース)。このデータは、22ヶ月齢のマウスでこれらの知見が観察されたように、老化プロセス中の変化を示す。無呼吸および拡張呼吸分析のためのインテラター信頼性を確認するために、ピアソン相関は2つの異なる研究者について計算された。レート間の高い一致が見つかりましたが、apnea のr = .99、拡張呼吸の場合 r = .86 の値で示されます。将来の研究では、対照群と比較して無呼吸数が増加し、神経成分に起因する呼吸障害を伝えるだろう。
図 1: 代表的なフロー トレース: (A)マウスがスニッフィングやグルーミングなどのアクティブな動作を示さない、静かなベースラインからのフロー トレース。(B) マウスがチャンバーの中を移動し、多くの呼吸が日常的に受け入れられない、我々の分析に含まれていない活動呼吸期間からの流れトレース。(C)呼吸の増加と続く無呼吸の期間を表示するフロートレース。すべてのトレースに対して 5 s ウィンドウが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:呼吸パラメータは、22ヶ月齢のマウスで10分と15sの穏やかな呼吸セグメントに似ています。気圧プレチスモグラフィーは、老化したマウス(n=16、22ヶ月)の呼吸データを収集するために使用した。n呼吸データは、2つの異なる時点、すなわちチャンバー内にあるマウスの60〜120分のマーク内の4つの15の穏やかな間隔の平均と一貫した穏やかな呼吸の10分間の間にマウスのために計算された。(A) 呼吸頻度 (呼吸/分).(B) 潮汐容積 (VT; ミリリットル/呼吸).(C) 微風換気 (VE; ミリリットル/分).(D) ひときびとの時間に対する潮の容積の比率 (VT/Ti; ミリリットル/秒).(E) 排出された二酸化炭素に対する微換気の比率(VE/VCO2/g)ポストホック補正後のグループ間に統計的に有意な差はありません(p > 0.025)。平均より上の値 >3 SD は外れ値と見なされ、データ セットから削除されました。データは平均値 ±SD として表示されます。
図3:4つの15の間隔の比較。呼吸データは、チャンバー配置の60〜120分以内に4つの別々の15の間隔のために穏やかな呼吸マウス(n = 16、22ヶ月)で計算された。(A) 呼吸頻度 (呼吸/分).(B) 潮汐容積 (VT; ミリリットル/呼吸).(C) 微風換気 (VE; ミリリットル/分).(D) ひときびとの時間に対する潮の容積の比率 (VT/Ti; ミリリットル/秒).(E) 排出された二酸化炭素に対する微換気の比率(VE/VCO2/g)時間セグメント間に統計的に有意な差はありません(p > 0.05)。外れ値は、平均値の上に >3 SD として定義され、削除されます。データは平均値 ±SD として表示されます。
図4:マウスの無呼吸と拡張呼吸数。無呼吸(呼吸なし≥0.5 s)および拡張呼吸(AB;1.25mL/s以上の吸入の急激な増加、続いて-0.75 mL/s未満の急激な呼気)が30〜60分の間の老化したマウス(n = 16、22ヶ月)にカウントされた。カウントを30分以上分析し、その期間の合計を報告しました。データは平均値 ±SD として表示されます。
図5:非拘束気圧プレチスモグラフィー(UBP)設定の概略図。全体の UBP 設定は、図に示した設定と同様である必要があります。チャンバーに出入りするガスの流量測定を測定する必要があり、ガス組成はデータ解釈のために知られている必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、マウスの静かな呼吸ベースラインに関する情報を提供するだけでなく、中央無呼吸および拡張呼吸に関するデータを収集する。代表的な結果は、10分の静かなベースラインが、古いマウスのコホートに対する平均4つの15 sの発作と比較して同様の呼吸パターンを有することを示している。重要なことに、15の試合は統計的に異なっていないし、これらのグループは、Leveneのテストを使用して互いにばらつきの違いを持っていません。これらのデータは、静かな呼吸を監視するのに1つの短い試合でも十分であることを示しています。しかし、15分対10分でマウス内の個々の変動を分析すると、10分の試合が最小限のスニッフィングとグルーミング活動を含むことができるため、異なる所見が生じる可能性があります。ただし、個々のマウスベースラインセグメントの比較にLeveneの検定を使用すると、このプロトコルで説明したものとは異なる分析が可能になります。全体として、この方法論の設計では、チャンバー内で60〜120分の間に取得できる15の呼吸セグメントを使用し、各マウスが静かなベースラインの長い持続時間を達成するのを待たせます。
ベースラインに必要な短い持続時間は、静かな呼吸のためにテストされるマウスのより不安/攪拌株を可能にする。より長い呼吸セグメント(すなわち、10または2分)の使用は、プロトコルの持続時間を長くし、マウスが3時間以内に静かな呼吸痕を表示しない場合、試験を放棄する必要があるところまで延長する。多くの実験計画には呼吸困難(すなわち低酸素症)が組み込まれているため、他のガスに割り当てられた延長時間は、ベースライン収集時間を標準化する必要性を強調している。静かな呼吸の単一の15 sの発作の使用は、チャンバー内で特に興奮し得るマウス(およびマウスの株)で作業することの懸念を和らげるのに役立つ。気圧プレチスモグラフィーを使用している間、研究ごとに約10%のマウスを除外する必要があることがわかりました。以前の慣れ親しんだ試験の実施は、実験の日にチャンバーに入れられたときにマウスがより速く落ち着かせることに失敗した。しかしながら、異なる株、性別、およびマウスの年齢はすべてチャンバー環境10,11に対して異なる反応をする可能性があるため、11いくつかのコホートでは習慣化技術が1212,1313に有用である可能性がある。我々の慣れ親しんだ試験は、実験の前に数日間、試験室のUBPチャンバーにマウスを1〜2時間配置することによるものだった。我々はこの手順に従って動物の行動に変化を見なかったが、以前の研究では、マウス12における自発的な身体活動をもたらす新規性効果を排除するために24時間の習慣化が必要であった。さらに、Kabirらの場合、ホームケージ内の気圧プレチスモグラフィーチャンバーと同様の大きさのプラスチックシリンダーを配置することは、実験13の前にラットにセットアップに慣れさせるのに有利であることがわかった。
このプロトコルはまた、神経制御の問題を示す中央無呼吸の定量化を介してマウスで可能な呼吸機能障害を明らかにする。ベースライン呼吸パターン収集の前に30分間の観察は、全ての16の老化したマウスが無呼吸のエピソードおよび拡張呼吸の多数を示すことを示した(図1CCに示される)。この老化したマウスコホートの多数の無呼吸は、実験に時間を追加することなく、別の重要な呼吸測定を定量化するこのプロトコルの能力を強調する。年齢および疾患の進行(該当する場合)は、無呼吸エピソードの存在および数に影響を与える可能性があることを留意すべきである。
静かな呼吸を特徴付けるためには、プロトコルの持続期間を通して気圧プレチスモグラフィーチャンバーとマウスを継続的に観察することが重要です。静かな呼吸の定量化のために、マウスは目を覚ましている必要がありますが、スニッフィング、グルーミング、探索などのアクティブな行動には参加しません(図1Aに示します)。睡眠中の呼吸のパターンは、目覚めの動物14、15のパターンとは異なるため、15覚醒状態の間の穏やかな呼吸の収集は重要です。静かな呼吸の長いセグメントは、実験計画によっては望ましくない睡眠期間を含むことができる可能性があります。この場合、静止呼吸の短いセグメントは、アクティブセグメントが短い(15 s)静かな呼吸セグメントに隣接すると睡眠中のデータ収集の可能性が低下するため、文書化するのに理想的です。チャンバー内のマウスの挙動はラットの行動とは大きく異なっているように見えるので、静かな呼吸の長いセグメントは、マウスモデルで取得するのが難しい可能性があることを観察しました。適切な呼吸セグメントのマウス呼吸フローを批判的に観察し、動物の行動を文書化することが重要です。換気が減少した場合や呼吸が不安定な場合でも、この方法は引き続き利用できます。これらの場合、実験者は15sセグメントを選択する際にコホートに目をつぶることが不可欠である。ソフトウェアプログラムは、15の期間中に100%の受け入れ率で、呼吸を区別する必要があります。静止したマウスがまだ不安である可能性があるため、動物がベースラインの行動基準を満たしていることを確認することに加えて、呼吸トレースに注意することをお勧めします。以前の研究では、ラットは穏やかな行動を示したが、検査室13内の制御された刺激に応答して変化した呼吸パターン(すなわち、頻度の増加)を示した。
周波数、VT、VE、吸気時間、およびVE / VCO2の測定値はすべて、アナライザーとUBPソフトウェアを使用して定量化され、文献で頻繁に報告されています。特に、VT および VE の計算では、Drorbaugh と Fenn 方程式16を使用し、体温、周囲のチャンバ温度、湿度、および気圧の既知の値を必要とします。VT 値と VE 値を正確にするため、実験全体を通してこれらのメジャーを収集することをお勧めします。システムによって計算される他の変数は注意して使用する必要があります。UBPは肺力学の直接的な尺度ではありません。したがって、気道抵抗に関連する変数(例えば、強化された一時停止[Penh])は、この注意点5を念頭に置いて解釈されるべきである。ソフトウェアによって計算された変数に影響を与える可能性のある UBP セットアップの追加コンポーネントには、流量とシステムの一般的なキャリブレーションが含まれます。シールとガスケットが正しく動作していることを確認し(漏れなし)、すべての機器を気圧プレチスモグラフィーチャンバーに適切に接続していることを確認します(図5)。チャンバーの出入りの流量は一貫して保たれるべきである。必要な流量は UBP 設定によって異なる場合があるため、実験の前にこれらの値を確認することが重要です。チャンバーへの流量は、タイムリーに新鮮な空気やガスの課題を提供するのに十分でなければなりません。また、代謝分析装置がチャンバー環境内にCO2を蓄積することなくO2とCO2を測定できるため、呼吸パターンが変化するリスクがあります。同様に、ガスミキサー/アナライザのキャリブレーションも、代謝パラメータを正確に測定するために定期的に実装する必要があります。
意識的なUBPのための他の考慮事項は、動物がテストされている間、実験室内の気晴らしを減らすことが含まれます。大きな音、異なる匂い、および部屋の中に重要でない人員の存在はすべて、マウスによって示される不安な行動を追加することができます。テストエリアとして小さな部屋を使用すると役立ちますが、これが不可能な場合は、チャンバーの周囲に段ボールの壁(小さな表示窓付)を設置して、マウスの気晴らしを軽減することができます。部屋内の電気的活動は、気圧プレチスモグラフィートレース内の追加のノイズを防ぐために、最小限に保つ必要があります。したがって、ソフトウェアが空のチャンバーからデータを収集している10分の間にフロートレースに注意することが重要です。これらのトレースは平坦なままにする必要があり、中断やわずかな波はノイズの兆候であり、対処する必要があります。ドアの開閉やHVAC機能からの圧力変化も誤った変動を引き起こす可能性があり、これらのアクションが最小限に起こることを保証することが重要です( また、発生時に警告する)ことが重要です。湿度は計算された潮量と微小換気にも影響を与える可能性があり、チャンバーと接続チューブが使用前に乾燥していることを確認することが非常に重要です。必要に応じて、フローインチューブとの順序でDrieriteビーズを使用すると、チャンバーの入り口に先立って空気中のすべての凝縮を除去することができます。このステップは、湿度が動物のケアと使用ガイド8(理想的にはセットポイントの10%以内)に記載されているレベルよりも日常的に高い場合に実施されます。湿度はまた、動物の存在のためにチャンバーに蓄積することができます。一部の湿度は正常であるが、動物が過度に活性であるか、またはより長い期間チャンバーに置かれた場合に構築し続ける可能性があります。湿度レベルが最高レベル(99.99%)に達した場合、同等の呼吸対策を維持するために、実験中にチャンバーを開いて拭き取る必要があります。ソフトウェアは、気圧、周囲温度、動物の温度、湿度の変化を説明します。「リンゴからリンゴへ」が年齢、株、性別を超えて比較されるように、妥当な範囲内で値を維持することがベストプラクティスです。また、マウスの概日サイクルと試験の時間範囲、ならびに部屋の特定の照明条件は、13、17,17を考慮する重要な詳細である。例えば、我々は通常、彼らのハウジングルーム(明暗のサイクルのいずれか)と3時間範囲内で18の照明にマウスをテストします。実験者はまた、ベースラインの選択の違いを防ぐために、データ収集と分析中に動物群に目をつぶったままにする必要があります。可能な場合、同じ実験者は、特定の実験ですべてのデータを収集し、すべてのトレースを分析する必要があります。実験者を動物群に目がくらみ続けるためのステップは、一日の同様の時間帯に無作為化とテストを行うだけでなく、調査の厳しさにとって極めて重要です。最終的には、フロー トレースを変更する可能性のある余分な要因があり、UBP を実行する際にはこれらの懸念事項を考慮する必要があります。
UBP法は、マウスの呼吸パターンを特徴付けるために使用される技術です。ベースライン測定は、15の呼吸セグメントを使用する場合、2時間以内に収集することができます。ここでは、若いマウスよりもチャンバー内でしばしば攪拌される老化したマウスで行うことができる方法を報告し、他の不安または活性マウス株もこのプロトコルでテストできることを示唆する。UBPから収集されたデータは非侵襲的であり、老化、薬物療法、および疾患進行に関する研究に有用である複数の時間ポイントにわたるテストを可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、アンジェラ・ル、サラ・ルビー、マリサ・ミッキーが動物のコロニーを維持してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、1R15 HD076379(L.R.D.)、3R15 HD076379(CNRをサポートするL.R.D.)、マクデヴィット自然科学学部研究員(BEE)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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