Eseguire la spettroscopia su nanoparticelle plasmoniche con microscopia a contrasto di tipo Nomarski basata su trasmissione

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di dettagliare un approccio collaudato per la preparazione di campioni di nanoparticelle plasmoniche e per l’esecuzione di spettroscopia a singola particella su di essi con microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC).

Abstract

La microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) è un potente strumento di imaging che è più comunemente impiegato per l’imaging di oggetti in Microscala utilizzando la luce a raggio visibile. Lo scopo di questo protocollo è quello di dettagliare un metodo collaudato per la preparazione di campioni plasmonici di nanoparticelle e l’esecuzione di spettroscopia a singola particella su di essi con la microscopia DIC. Per eseguire esperimenti di spettroscopia ripetibile è necessario seguire con attenzione diversi passaggi importanti. In primo luogo, i punti di interesse possono essere incisi nel substrato del campione, che aiuta a localizzare la superficie del campione e a tracciare la regione di interesse durante gli esperimenti. Successivamente, il substrato deve essere adeguatamente pulito di detriti e contaminanti che possono altrimenti ostacolare o oscurare l’esame del campione. Una volta preparato correttamente il campione, il percorso ottico del microscopio deve essere allineato, utilizzando l’illuminazione Kohler. Con un microscopio DIC standard Nomarski, può essere necessaria la rotazione del campione, in particolare quando le nanoparticelle plasmoniche presentano proprietà ottiche dipendenti dall’orientamento. Poiché la microscopia DIC ha due campi di polarizzazione ortogonale intrinseci, il modello di contrasto DIC dipendente dalla lunghezza d’onda rivela l’orientamento delle nanoparticelle plasmoniche a forma di asta. Infine, l’acquisizione dei dati e l’analisi dei dati devono essere accuratamente eseguite. È comune rappresentare i dati della spettroscopia basata su DIC come valore di contrasto, ma è anche possibile presentarlo come dati di intensità. In questa dimostrazione di DIC per la spettroscopia a singola particella, il focus è sulle nanoparticelle d’oro sferiche e a forma di asta.

Introduction

A partire dagli anni ottanta, la microscopia a contrasto differenziale (DIC) è stata ampiamente vista come un importante metodo di imaging riservato agli oggetti in Microscala all’interno delle scienze biologiche. Tuttavia, durante il suo sviluppo negli anni cinquanta e sessanta, era inteso come una tecnica per la scienza dei materiali¹. Con i recenti progressi nelle scienze dei materiali legati alle nanoparticelle plasmoniche, si è tenuto un maggiore interesse per la caratterizzazione dei materiali con microscopia ottica.

Molte tecniche ottiche sono certamente disponibili per la caratterizzazione dei nanomateriali (ad esempio, campo scuro, campo chiaro, luce polarizzata, fluorescenza, ecc.). Campo oscuro è ampiamente popolare nella ricerca di nanoparticelle, ma si basa esclusivamente sulla raccolta di dispersione e fornisce informazioni limitate su campioni complessi². La fluorescenza può essere utile, ma solo con campioni che si illuminalizzano o che possono essere adeguatamente macchiati. La microscopia DIC ha diversi tratti che lo rendono uno strumento prezioso per l’analisi delle nanoparticelle. I vantaggi più frequentemente dichiarati di DIC rispetto ad altri metodi e per quanto riguarda le nanoparticelle plasmoniche sono: nessuna colorazione del campione richiesta, nessun effetto alone, profondità di campo superficiale e alta risoluzione laterale³. DIC ha ulteriori punti di forza che sono preziosi per la ricerca di nanoparticelle plasmoniche. Prima di tutto, sono presenti due campi di polarizzazione intrinseci e ortogonali, che possono essere misurati simultaneamente per scopi di spettroscopia². In secondo luogo, il segnale depolarizzato delle nanoparticelle non viene catturato nell’immagine finale², che può essere una causa di grave preoccupazione nelle misurazioni della spettroscopia di campo scuro.

Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una chiara metodologia per l’utilizzo della luce trasmessa Nomarski DIC microscopia per eseguire la spettroscopia sulle nanoparticelle plasmoniche. Anche se DIC è una tecnica potente che può essere applicata a materiali altamente diversificati, è anche una tecnica che richiede grande abilità e comprensione per operare correttamente durante l’imaging di nanoparticelle. La microscopia di Nomarski DIC basata sulla trasmissione ha un percorso luminoso complesso¹ che verrà esaminato solo brevemente qui. Il treno ottico di DIC viene visualizzato in Figura 1. La luce viene trasmessa attraverso il microscopio prima di essere passata attraverso un polarizzatore e un prisma Nomarski che divide il fascio prima di essere concentrato dal condensatore sul piano del campione. Dopo aver attraversato l’obiettivo, la luce incontra una trave-combinando Prisma Nomarski e un analizzatore prima di uscire al rivelatore. I due polarizzatori e i prismi Nomarski sono fondamentali per la formazione dell’immagine DIC e sono responsabili della produzione dei due campi di polarizzazione ortogonale di DIC¹. Per il lettore interessato a conoscere meglio i principi di lavoro e il percorso ottico dei microscopi DIC Nomarski, o le differenze tra Nomarski DIC e altri stili di DIC, si prega di fare riferimento ad altri conti ben scritti su questi argomenti^{1, 4 , 5} il ^{, 6} il ^{, 7}. il

È altrettanto importante comprendere la natura di base delle nanoparticelle plasmoniche prima di tentare di eseguire la spettroscopia su di essi, che si tratti di Nomarski DIC, campo scuro o qualsiasi altra tecnica di microscopia. Nel campo della plasmonica, le nanoparticelle sono definite come particolati con dimensioni sulla scala di 10-100 Nm^8,9. Le nanoparticelle possono assumere molte forme (ad esempio sfere, aste, stelle, manubri, ecc.), e la maggior parte delle loro proprietà importanti derivano da interazioni con la luce nella gamma infrarossa-visibile-vicino infrarosso dello spettro elettromagnetico. Il termine “plasmonico” non è limitato alle nanoparticelle¹⁰; Tuttavia, quando si discute di nanoparticelle, viene utilizzato in riferimento alla risonanza plasmonica superficiale localizzata (LSPR). LSPR è un fenomeno in cui gli elettroni di conduzione in una nanoparticelle oscillano a causa di un’interazione Coulombica con radiazioni elettromagnetiche di una banda di frequenza molto specifica e relativamente ristretta⁸. A queste stesse frequenze, le nanoparticelle plasmoniche mostrano un aumento dell’assorbimento e della dispersione della luce, rendendole osservabili con la microscopia ottica. In molti casi, è preferibile osservare le nanoparticelle mentre si posizionano filtri passa-banda prima del condensatore², per migliorare il contrasto dell’imaging e per eliminare la luce che non riesce a indurre l’effetto LSPR. L’utilizzo dei filtri consente inoltre di eseguire esperimenti di spettroscopia a singola particella.

Il comportamento ottico correlato a LSPR dipende fortemente dalle dimensioni e dalla forma delle nanoparticelle e può essere studiato con molte tecniche di microscopia ottica. Tuttavia, al fine di decifrare le informazioni di orientamento delle nanoparticelle plasmoniche con una forma anisotropa (cioè non sferica), è necessario utilizzare la polarizzazione del campo luminoso. Ruotando con cautela il campo di polarizzazione o il substrato campione a piccoli incrementi, è possibile monitorare le proprietà spettroscopiche dipendenti dall’orientamento delle singole nanoparticelle. La rotazione e la polarizzazione possono anche aiutare a determinare se una funzione spettrale è dovuta ad un’oscillazione dipolare o superiore dell’ordine degli elettroni superficiali delle nanoparticelle. Tuttavia, nel caso delle nanoparticelle isotrope (cioè sferiche), il profilo spettrale rimane sostanzialmente invariato al momento della rotazione del campione sotto luce polarizzata.

Quando viene visualizzato attraverso un microscopio DIC (Figura 2), le nanoparticelle hanno un disco arioso con un aspetto bianco e nero in ombra su uno sfondo grigio. Le nanoparticelle sferiche manterranno questo aspetto in rotazione e con il cambio di filtri passa-banda; Tuttavia, le particelle svaniranno gradualmente dalla vista poiché la lunghezza d’onda centrale del filtro diventa ulteriormente separata dall’unica lunghezza d’onda dipolare LSPR della sfera¹¹. La comparsa di nanorodi può cambiare abbastanza drammaticamente come sono ruotati². I nanorodi hanno due bande LSPR con comportamento dipolare, la cui posizione si basa sulle dimensioni fisiche dei nanorodi. Quando l’asse longitudinale di un aggregato nanorod è orientato parallelamente a uno dei campi di polarizzazione DIC, il disco arioso apparirà tutto bianco o tutto nero se visualizzato con un filtro passa-banda associato a quella lunghezza d’onda LSPR. Dopo aver ruotate il campione 90 °, si avrà il colore opposto. In alternativa, poiché l’asse trasversale di un nanorodo è perpendicolare all’asse longitudinale, l’asta assumerà il colore opposto quando si passa da un filtro che corrisponde alle lunghezze d’onda LSPR per i due assi. In altri orientamenti e impostazioni del filtro, i nanorodi appariranno più come sfere, presentando una varietà di modelli di dischi ariosi in fusione di ombre. Per i nanorodi con un asse trasversale < 25 Nm, può essere difficile rilevare il segnale a quella lunghezza d'onda di LSPR utilizzando la microscopia DIC.

Per eseguire la spettroscopia a singola particella, è importante utilizzare i componenti ottici corretti e allinearli correttamente. Deve essere utilizzato un obiettivo in grado di microscopia DIC. Per esperimenti di particelle singole, gli obiettivi di 80x o 100x Oil sono ideali. I prismi di Nomarski DIC sono normalmente disponibili in tre varietà: standard, ad alto contrasto e ad alta risoluzione. Il tipo ideale dipende fortemente dallo scopo dell’esperimento e dalle dimensioni delle nanoparticelle. I prismi standard vanno bene per molti esperimenti; ma quando si lavora con nanoparticelle più piccole (< 50 Nm), i prismi ad alto contrasto possono essere utili, poiché il contrasto delle particelle diminuisce con la diminuzione delle particelle nella dimensione¹¹. Regolando il contrasto DIC si ottiene ruotando un polarizzatore o traducendo uno dei prismi DIC, a seconda della marca del microscopio o del modello⁶.

Dopo aver impostato l’illuminazione Kohler e le impostazioni del polarizzatore, è fondamentale non regolare queste impostazioni durante la raccolta dei dati della spettroscopia. Inoltre, un segnale di fondo medio costante deve essere mantenuto in ogni momento durante la raccolta dei dati, anche quando si passa tra i filtri e le impostazioni angolari. L’effettivo valore di sfondo ideale dipende dalla gamma dinamica della fotocamera scientifica, ma in generale, lo sfondo dovrebbe essere nell’intervallo di 15% – 40% del livello di rilevamento massimo della fotocamera. Ciò riduce la probabilità di saturare il sensore della fotocamera, consentendo al contempo un contrasto ottimale delle particelle. Per la raccolta dei dati della spettroscopia, è necessario lavorare con una fotocamera scientifica che cattura le immagini in bianco e nero, a differenza di una fotocamera a colori.

La preparazione dei campioni è un altro aspetto critico dell’imaging delle nanoparticelle plasmoniche. È imperativo che gli operatori della microscopia DIC abbiano una comprensione delle proprietà ottiche del campione e del substrato del campione. Il vetro per microscopio “pre-pulito” non è sufficientemente preparato per l’imaging delle nanoparticelle e deve essere adeguatamente ripulito prima della deposizione del campione per garantire un’osservazione senza ostacoli del campione. Molti protocolli di pulizia per le diapositive del microscopio sono stati documentati in precedenza¹², ma non è un passo che viene normalmente riportato negli studi sperimentali.

Infine, i metodi di analisi dei dati sono il componente finale della spettroscopia a singola particella. Devono essere misurate le intensità massime e minime per ogni nanoparticelle, nonché la media locale di base. Le particelle di interesse devono trovarsi in aree senza detriti di fondo, difetti del substrato o illuminazione irregolare. Un metodo per determinare il profilo spettrale di un nanoparticelle è calcolando il contrasto delle particelle ad ogni lunghezza d’onda, usando l’equazione sotto^11,13,14,15:

In alternativa, lo spettro di una singola particella può essere suddiviso nei suoi singoli componenti di segnale massimo e minimo, che rappresentano i due campi di polarizzazione di DIC, mostrando così i due spettri direttivamente dipendenti raccolti simultaneamente, attraverso le due equazioni:

Protocol

1. preparazione del campione con vetrini di microscopia in vetro standard Preparare vetrini per microscopio in vetro per la deposizione del campione.Nota: in alcune circostanze, può essere più appropriato conservare il vetro in acqua ultrapura invece di etanolo. Tuttavia, la conservazione in acqua o aria rende il vetro idrofobico nel tempo. Per risultati ottimali, acquistare vetrini per microscopio in vetro o quarzo e vetro di copertura. Utilizzando una penna tracciatura, posizionare un…

Representative Results

Quando si lavora con campioni che sono abbastanza grandi da essere osservati ad occhio nudo, non è normalmente necessario collocare punti di contatto sul substrato di vetro. Tuttavia, quando si lavora con nanomateriali o quando è richiesta la rotazione del campione, i punti di interesse possono fornire un metodo semplice per localizzare, distinguere e tracciare l’orientamento del campione. Anche se le tecniche più sofisticate possono essere utilizzate per lasciare punti di interesse su…

Discussion

Quando si imaging con la microscopia DIC, è fondamentale ottimizzare i componenti ottici prima di raccogliere i dati. Anche piccole regolazioni al polarizzatore nel mezzo di un esperimento possono comportare impatti significativi sui dati finali⁶. Inoltre, diversi materiali richiedono diverse impostazioni polarizzatore. Anche se le grandi dimensioni dei gradini sono state utilizzate qui per dimostrare l’effetto dell’angolo di polarizzazione, in un esperimento reale, è imperativo ottimizzare l’im…

Materials

Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm