배아 패턴 스케일링 연구를 위한 제 브라 피시 수술 크기 감소
Summary
여기서, 우리는 정상적인 발달 과정을 방해 하지 않고 제 브라 피시 배아의 크기를 감소 시키는 방법을 설명 한다. 이 기술을 사용 하면 크기 변경에 대 한 패턴 스케일링 및 개발 견고성을 연구할 수 있습니다.
Abstract
발달 과정에서, 배아는 자신의 신체 크기에 자신의 신체 패턴을 일치 시키는 현저한 능력을 나타낸다; 그들의 신체 비율은 특정 한계 내에서 더 크거나 작은 배아 에서도 유지 됩니다. 이 스케일링 현상은 한 세기 동안 주목을 받고 있지만, 근본적인 메커니즘을 이해 하는 것은 다양 한 크기의 배아에서 발달 역학에 대 한 정량적 인 설명의 부족으로 인해 제한 되었습니다. 이 한계를 극복 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징에 대 한 큰 이점이 zebrafish 배아의 크기를 감소 시키는 새로운 기술을 개발 했습니다. 우리는 별도의 단계에서 blastula 단계에서 세포와 노 른 자의 균형 잡힌 제거 후, 배아는 신속 하 게 올바른 조건에서 회복 하 고 더 작은 하지만 그렇지 않으면 정상적인 배아로 발전 할 수 있음을 보여줍니다. 이 기술은 특별 한 장비가 필요 하지 않기 때문에 쉽게 적응 할 수 있으며, 형태 적 매개 패터 닝의 견고성을 포함 하 여 광범위 한 스케일링 문제를 연구 하는 데 사용 됩니다.
Introduction
과학자 들은 배아 크기가 자연 및 실험 조건1,3에서 크게 다를 수 있지만 태아가 일정 한 신체 비율을 형성 하는 현저한 능력을가지고 있다고 오랫동안 알려져 있다. 이론 및 실험적 연구의 수십 년에도 불구 하 고, 크기 변화에이 견고성, 불리는 스케일링, 그리고 그것의 근본적인 메커니즘은 많은 조직과 기관에서 알 수 없는 남아. 직접 개발 시스템의 역학을 포착 하기 위해, 우리는 생체 내 라이브 이미징5에서 큰 이점을가지고 zebrafish4에서 재현 가능 하 고 간단한 크기 감소 기술을 확립 했다.
Zebrafish는 발달 생물학을 포함 하 여 생물학의 여러 학문을 연구 하는 동물 모델 척추 동물 역임 했습니다. 특히, 제 브라 피쉬는 생체 내 라이브 이미징 (6 ) 때문에 1) 개발이 정상적으로 진행 될 수 있으며 모와 달걀 껍질, 그리고 2) 배아가 투명 하다. 또한, 배아는 일부 온도 및 환경 변동을 견딜 수 있으며,이는 실험실 조건에서 공부 하는 것을 허용 한다. 또한, 모 르 폴 리노와 mRNA 주입7,8에의 한 종래의 유전자 발현 섭 동에 더하여, 최근 CRISPR/Cas9 기술의 진보는 제 브라 피쉬 고효율9에서 역 유전학을 만들었다. 더욱이, 세포 이식 또는 조직 수술과 같은 발생 학의 많은 고전 기술이4,10,11에 적용 될 수 있다.
원래 크기 감소 기법은 수 륙 양용 및 기타 비 척추 동물 동물12에서 개발 되었다. 예를 들어, xenopus laevis에서 또 다른 인기 있는 척추 동물 동물 모델 인 blastula 단계에서 동물-식물성 축을 따라 양분는 크기 감소 배아12,13을 생산할 수 있다. 그러나, 우리의 손에서이 한 단계 접근은 제 브라 물고기에 있는도 배 화 된 배아를 초래 하 고, 아마도 등 쪽 결정 개미는 불균일 하 게 분포 하 고 하나는 배아의 형태학에서 그들의 현지화를 알 수 없습니다. 여기에서 우리는 일반적으로 개발 하지만 작은 배아를 생산 zebrafish에 대 한 대안 2 단계 베 지 기법을 보여줍니다. 이 기술을 통해 세포는 처음에는 동물 극에서 제거 되 고, 조직자 활동에서 부족 한 순진한 세포의 영역입니다. 노 른 자와 세포의 양을 균형을 유지 하기 위해,이는 상피와 이후의 형태 형성에 중요 한, 노 른 자는 제거. 여기서는이 프로토콜에 대해 상세히 설명 하 고, 패턴 형성에서의 크기 불변의 두 가지 예를 제공 합니다. 솜 사이트 형성 및 복 부 신경 튜브 패터 닝. 정량적 이미징과 결합 하 여 크기 감소 기법을 활용 하 여 진드기와 신경 관의 크기가 감소 된 배아의 크기에 미치는 영향을 조사 했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
역사적으로, 척추 동물 동물 들 중에서, 크기 감소는 주로 배아를 수 륙 양용으로 사용 하 여 수행 되었으며, blastula 스테이지 (12)에서 동물-식물성 축을 따라 배아를 양분 하였다. 그러나, 우리는 배아를 이등분 때 개구리와 제 브라 피쉬 배아 사이에는 주로 두 가지 차이점이 있습니다. 첫째, 제 브라이 어 배아가 비 대 한 (blastula 단계)의 관용이 되는 단계에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본 과학 기술 기구 (JPMJPR11AA)의 프레스 프로그램 및 건강 보조금 (R01GM107733)의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
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