Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária
Summary
Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.
Abstract
No processo de desenvolvimento, os embriões exibem uma habilidade notável de combinar seu teste padrão do corpo a seu tamanho de corpo; sua proporção corporal é mantida mesmo em embriões que são maiores ou menores, dentro de certos limites. Embora este fenômeno de escamação tenha atraído a atenção por mais de um século, a compreensão dos mecanismos subjacentes tem sido limitada, devido em parte à falta de descrição quantitativa da dinâmica do desenvolvimento em embriões de tamanhos variados. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma técnica nova para reduzir cirùrgica o tamanho de embriões do zebrafish, que têm grandes vantagens para a imagem latente vivo in vivo. Nós demonstramos que após a remoção equilibrada das pilhas e da gema no estágio da blástula em etapas separadas, os embriões podem rapidamente recuperar-se as circunstâncias direitas e tornar-se em embriões menores mas de outra maneira normais. Desde que esta técnica não exige o equipamento especial, é facilmente adaptável, e pode ser usada para estudar uma escala larga de problemas de escamação, incluindo o robustez do patterning mediado morfogênico.
Introduction
Os cientistas têm sabido por muito tempo que os embriões têm uma habilidade notável de dar forma a proporções constantes do corpo embora o tamanho do embrião possa variar extremamente circunstâncias naturais e experimentais1,2,3. Apesar de décadas de estudos teóricos e experimentais, essa robustez à variação de tamanho, denominada escamação, e seus mecanismos subjacentes permanecem desconhecidos em muitos tecidos e órgãos. Para captar diretamente a dinâmica do sistema em desenvolvimento, estabeleceu-se uma técnica de redução de tamanho simples e reprodutível em zebrafish4, que tem a grande vantagem em imagens ao vivo in vivo5.
Zebrafish serviu como um animal modelo vertebrado para estudar várias disciplinas da biologia, incluindo a biologia do desenvolvimento. Em particular, o zebrafish é ideal para a imagem latente vivo6 de in vivo porque 1) o desenvolvimento pode prosseguir normalmente fora da mãe e do escudo de ovo, e 2) os embriões são transparentes. Além disso, os embriões podem resistir a alguma temperatura e flutuações ambientais, o que permite que eles sejam estudados em condições laboratoriais. Além da perturbação da expressão gênica convencional pela injeção de morfolino emRNA7,8, avanços recentes na tecnologia crispr/Cas9 tornaram a genética reversa em zebrafish altamente eficiente9. Além disso, muitas técnicas clássicas em embriologia, como transplante celular ou cirurgia tecidual, podem seraplicadas 4,10,11.
As técnicas de redução de tamanho foram originalmente desenvolvidas em anfíbios e outros animais não vertebrados12. Por exemplo, no Xenopus laevis, outro modelo popular de animais vertebrados, a bisection ao longo do eixo animal-vegetal na fase blástula pode produzir embriões com redução de tamanho12,13. Entretanto, em nossas mãos esta aproximação de uma etapa conduz aos embriões dorsalizados ou ventralized no zebrafish, presumivelmente porque os determinantes dorsais são distribuídos desigual e um não pode saber sua localização da morfologia dos embriões. Aqui nós demonstramos uma técnica de corte de duas etapas alternativa para o zebrafish que produz embriões normalmente tornando-se mas menores. Com esta técnica, as pilhas são removidas primeiramente do pólo animal, uma região das pilhas ingênuas que faltam na atividade do organizador. Para equilibrar a quantidade de gemas e células, que é importante para a Epibolia e posterior morfogênese, gema é então removida. Aqui, detalhamos este protocolo e fornecemos dois exemplos de invariância de tamanho na formação de padrões; formação somita e padronização do tubo neural ventral. Combinado com a imagem latente quantitativa, nós utilizamos a técnica da redução do tamanho para examinar como os tamanhos dos somitos e do tubo neural são afetados em embriões reduzidos tamanho.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historicamente, entre os animais vertebrados, a redução do tamanho tem sido realizada principalmente com embriões de anfíbios, dividindo os embriões ao longo do eixo animal-vegetal em uma fase de blástula12. No entanto, existem principalmente duas diferenças entre os embriões de rã e de zebrafish quando Bisect embriões. Primeiro, no estágio em que os embriões de zebrafish se tornam tolerantes à dividindo (fase blástula), o organizador está localizado em …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado pelo programa PRESTO da Agência de ciência e tecnologia do Japão (JPMJPR11AA) e um subsídio nacional de institutos de saúde (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
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