Reducción de tamaño quirúrgico del pez cebra para el estudio de la escala de patrón embrionario
Summary
Aquí describimos un método para reducir el tamaño de los embriones de pez cebra sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Esta técnica permite el estudio de la escala del patrón y la robustez del desarrollo contra el cambio de tamaño.
Abstract
En el proceso de desarrollo, los embriones exhiben una notable capacidad para igualar su patrón corporal con su tamaño corporal; su proporción corporal se mantiene incluso en embriones que son más grandes o más pequeños, dentro de ciertos límites. Aunque este fenómeno de escala ha atraído la atención durante más de un siglo, la comprensión de los mecanismos subyacentes ha sido limitada, debido en parte a la falta de una descripción cuantitativa de la dinámica del desarrollo en embriones de tamaños variados. Para superar esta limitación, desarrollamos una nueva técnica para reducir quirúrgicamente el tamaño de los embriones de pez cebra, que tienen grandes ventajas para la imagen en vivo in vivo. Demostramos que después de la eliminación equilibrada de las células y la yema en la fase blástula en pasos separados, los embriones pueden recuperarse rápidamente bajo las condiciones adecuadas y convertirse en embriones más pequeños pero de otro modo normales. Dado que esta técnica no requiere equipo especial, es fácilmente adaptable y se puede utilizar para estudiar una amplia gama de problemas de escalado, incluida la robustez de los patrones mediada por morfogeno.
Introduction
Los científicos han sabido desde hace tiempo que los embriones tienen una capacidad notable para formar proporciones corporales constantes, aunque el tamaño del embrión puede variar grandemente tanto en condiciones naturales como experimentales1,2,3. A pesar de décadas de estudios teóricos y experimentales, esta robustez a la variación de tamaño, denominada escalado, y sus mecanismos subyacentes siguen siendo desconocidos en muchos tejidos y órganos. Con el fin de captar directamente la dinámica del sistema en desarrollo, establecimos una técnica de reducción de tamaño reproducible y simple en el pez cebra4, que tiene la gran ventaja de la imagen en vivo in vivo5.
El pez cebra ha servido como un animal vertebrado modelo para estudiar múltiples disciplinas de la biología, incluyendo la biología del desarrollo. En particular, el pez cebra es ideal para imágenes en vivo in vivo6 porque 1) el desarrollo puede proceder normalmente fuera de la madre y la cáscara de huevo, y 2) los embriones son transparentes. Además, los embriones pueden soportar algunas fluctuaciones de temperatura y ambientales, lo que les permite ser estudiados en condiciones de laboratorio. También, además de la perturbación convencional de la expresión génica por morfolinos y mRNA injection7,8, los avances recientes en la tecnología CRISPR/Cas9 han hecho que la genética inversa en el pez cebra altamente eficiente9. Además, muchas técnicas clásicas en la embriología, como el trasplante de células o la cirugía de tejidos se pueden aplicar4,10,11.
Las técnicas de reducción de tamaño se desarrollaron originalmente en anfibios y otros animales no vertebrados12. Por ejemplo, en Xenopus laevis, otro modelo animal de vertebrado popular, la bisección a lo largo del eje animal-vegetal en blástula Stage puede producir embriones reducidos de tamaño12,13. Sin embargo, en nuestras manos este enfoque de un solo paso da lugar a embriones dorsalizados o ventralizados en el pez cebra, presumiblemente porque los determinantes dorsales se distribuyen de manera desigual y uno no puede conocer su localización de la morfología de los embriones. Aquí demostramos una técnica alternativa de troceo de dos pasos para el pez cebra que produce embriones normalmente en desarrollo pero más pequeños. Con esta técnica, las células se eliminan por primera vez del polo animal, una región de células ingenuas que carecen de actividad organizadora. Para equilibrar la cantidad de yemas y células, que es importante para la morfogénesis epibolia y posterior, la yema se retira. Aquí, detallamos este protocolo y proporcionamos dos ejemplos de invarianza de tamaño en la formación de patrones; formación de somita y patrón de tubo neural ventral. En combinación con la imagen cuantitativa, utilizamos la técnica de reducción de tamaño para examinar el modo en que los tamaños de las somitas y el tubo neural se ven afectados por el tamaño de los embriones reducidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Históricamente, entre los animales vertebrados, la reducción de tamaño se ha realizado principalmente utilizando embriones de anfibios, mediante la bisección de los embriones a lo largo del eje animal-vegetal en una etapa de blástula12. Sin embargo, existen principalmente dos diferencias entre los embriones de rana y pez cebra cuando biseccionamos embriones. En primer lugar, en la etapa en que los embriones de pez cebra se vuelven tolerantes de bisección (blástu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por el programa PRESTO de la Agencia de ciencia y tecnología de Japón (JPMJPR11AA) y una subvención de los institutos nacionales de salud (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
