Kirurgisk storleks reduktion av zebra fisk för studiet av embryonala mönster skalning
Summary
Här beskriver vi en metod för att minska storleken på zebra fiskar embryon utan att störa normala utvecklings processer. Denna teknik gör det möjligt att studera mönster skalning och utveckling robusthet mot storleks ändring.
Abstract
I utvecklings processen, embryon uppvisar en anmärknings värd förmåga att matcha deras kropps mönster till sin kropps storlek; deras kropps andel bibehålls även i embryon som är större eller mindre, inom vissa gränser. Även om detta fenomen av skalning har uppmärksam Mats i över ett århundrade, att förstå de bakomliggande mekanismerna har begränsats, på grund av en brist på kvantitativ beskrivning av utvecklingsdynamik i embryon av varierande storlek. För att övervinna denna begränsning, vi utvecklat en ny teknik för att kirurgiskt minska storleken på zebra fiskar embryon, som har stora fördelar för in vivo Live Imaging. Vi visar att efter bal anse rad borttagning av celler och äggula på blastula scenen i separata steg, embryon kan snabbt återhämta sig under rätt betingelser och utvecklas till mindre men annars normala embryon. Eftersom denna teknik inte kräver särskild utrustning, är det lätt anpassningsbar, och kan användas för att studera ett brett spektrum av skalnings problem, inklusive robusthet av morfogen medierad mönstrande.
Introduction
Forskarna har länge känt till att embryon har en anmärknings värd förmåga att bilda konstanta kropps proportioner även om embryots storlek kan variera kraftigt både under naturliga och experimentella förhållanden1,2,3. Trots årtionden av teoretiska och experimentella studier är denna robusthet för storleks variation, kallad skalning, och dess bakomliggande mekanismer fortfarande okänd i många vävnader och organ. För att direkt fånga dynamiken i utvecklings systemet, etablerade vi en reproducerbar och enkel storlek reducerings teknik i zebra fiskar4, som har den stora fördelen i in vivo Live Imaging5.
Zebrafish har fungerat som en modell ryggradsdjur att studera flera discipliner av biologi, inklusive utvecklings bio Logi. I synnerhet är zebra fiskar idealisk för in vivo Live Imaging6 eftersom 1) utveckling kan fortsätta normalt utanför mamman och ägget skalet, och 2) embryona är transparenta. Dessutom kan embryona motstå vissa temperatur-och miljö variationer, vilket gör det möjligt att studera dem under laboratorie förhållanden. Dessutom, förutom konventionella gen uttryck störning av morfolino och mRNA injektion7,8, senaste framstegen i crispr/Cas9 Technology har gjort omvänd genetik i zebra fiskar mycket effektiv9. Dessutom kan många klassiska tekniker i embryologi, såsom cell transplantation eller vävnads kirurgi appliceras4,10,11.
Storleks reducerings tekniker utvecklades ursprungligen i groddjur och andra icke-ryggradsdjur12. Till exempel, i Xenopus laevis, en annan populär ryggradsdjur modell, bisektion längs djur-Vegetal axel på blastula Stage kan producera storlek-reducerade embryon12,13. Men i våra händer detta ett steg tillvägagångs sätt resulterar i dorsalized eller ventralized embryon i zebra fisk, förmodligen eftersom rygg determinanter fördelas ojämnt och man kan inte veta deras lokalisering från morfologi av embryon. Här demonstrerar vi en alternativ tvåstegs hacknings teknik för zebra fiskar som producerar normalt utvecklade men mindre embryon. Med denna teknik tas cellerna först bort från djur staven, en region av naiva celler som saknar organisatörsaktivitet. För att balansera mängden äggula och celler, vilket är viktigt för epiboly och efterföljande morfogenes, är äggula sedan bort. Här, vi detalj detta protokoll och ge två exempel på storlek inavvikelse i mönster bildning; somite formation och ventrala neuralrör mönster. Kombinerat med kvantitativ avbildning, utnyttjade vi storleks reducerings tekniken för att undersöka hur storleken på somiter och neuralrör påverkas i storlek reducerade embryon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historiskt har, bland ryggradsdjur, storleks reduktion huvudsakligen utförts med hjälp av amfibiska embryon, genom att de embryon som finns längs den animaliska vegetala axeln har använts på ett blastula Stadium12. Men det finns främst två skillnader mellan groda och zebra fisk embryon när vi Tudela embryon. Först, vid det skede då zebra fisk embryon blir toleranta av bisecting (blastula skede), är arrangören ligger i ett begränsat område av blastula marg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av PRESTO-programmet för Japans vetenskaps-och teknik byrå (JPMJPR11AA) och ett nationellt institut för hälso bidrag (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
