JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Mønster-utløst oksidativt burst og frøplante Veksthemming analyser i Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Dette papiret beskriver to metoder for kvantifisere forsvar responser i Arabidopsis thaliana etter eksponering for immun elicitors: forbigående oksidativt utbrudd, og hemming av frøplante vekst.

Abstract

Planter har utviklet seg et robust immunsystem til å oppfatte patogener og beskytte mot sykdom. Dette papiret beskriver to analyser som kan brukes til å måle styrken av immun aktivering i Arabidopsis thaliana etter behandling med elicitor molekyler. Presentert først er en metode for å fange den raskt indusert og dynamisk oksidativt utbrudd, som kan overvåkes ved hjelp av en luminol-basert analyse. Presentert andre er en metode som beskriver hvordan å måle immun-indusert hemming av frøplante vekst. Disse protokollene er rask og pålitelig, ikke krever spesialisert opplæring eller utstyr, og er mye brukt til å forstå det genetiske grunnlaget for anlegget immunitet.

Introduction

Å oppfatte og forsvare seg mot patogener, har planter utviklet membran-bundet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) som oppdager bevarte mikrobielle molekyler utenfor cellen kjent som mikrobe-assosiert molekylær mønstre (MAMPs)1. Bindingen av MAMPs til deres beslektet PRRs initierer protein kinase-mediert immun signalering resulterer i bredspektret sykdom motstand2. En av de tidligste svarene etter PRR aktivering er fosforylering og aktivering av integrert plasma membran RESPIRATORISK BURST OKSIDASE HOMOLOGE (RBOH) proteiner som katalysere produksjonen av ekstracellulære reaktive oksygen arter (ROS)3 , 4. ros spiller en viktig rolle i å etablere sykdomsresistens, opptrer både som sekundær budbringere å spre immun signalering samt direkte antimikrobielle agenter5. Den første observasjon av en immun-elicited oksidativt utbrudd ble beskrevet ved hjelp av potet knoller av CV. Rishiri etter Phytophthora infestans inoculation6. ROS produksjonen har blitt evaluert i flere plantearter ved hjelp av blad plater7, celle suspensjon kulturer8, og protoplasts6. Beskrevet her er en enkel metode for assaying mønster-utløst ROS produksjon i blad plater av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Som et svar på MAMP persepsjon, aktivert RBOH proteiner katalysere produksjon av superoxide radikaler (O2–), hydroksyl radikaler (• Oh), og singlet oksygen (1O2) som omdannes til hydrogen peroxide (H2o 2) i ekstracellulære plass9. H2O2 kan bli kvantifisert av luminol-baserte kjemiluminescens i nærvær av oksiderende agent pepperrot peroksidase (HRP)10. HRP oksiderer H2O2 GENERERER en natriumhydroksid (Oh−) og oksygen gass (O2) som reagerer med luminol for å produsere en ustabil mellomliggende som frigjør et foton av lys10. Foton utslipp kan være kvantifisert som relative lys enheter (RLU) ved hjelp av en mikroplate leser eller imager i stand til å oppdage luminescence, som har blitt standard stykker av utstyr i de fleste molekylære laboratorier. Ved å måle lyset som produseres over et 40-60-minutters intervall, kan en forbigående oksidativt burst oppdages så tidlig som 2-5 minutter etter elicitor behandling, med topp på 10-20 minutter, og tilbake til basal nivåer etter ~ 60 minutter11. Den kumulative lys produsert over denne tiden kurset kan brukes som et mål på immunforsvaret tilsvarende aktivering av RBOH proteiner12. Beleilig, ikke denne analysen ikke krever spesialisert utstyr eller tungvint prøve forberedelser.

Topp kort tid etter MAMP deteksjon, er oksidativt utbrudd betraktet som en tidlig immunrespons, sammen med MAPK aktivering og etylen produksjon5. Senere uimottakelig responser inkluderer transcriptional omprogrammering, nålene nedleggelse, og callose deponering2,5. Langvarig eksponering for MAMPs kontinuerlig aktiverer energisk-kostbare immun signalering resulterer i Hemming av plantevekst, antyder en trade-off mellom utvikling og immunitet13. Mønster-utløst frøplante veksthemming (SGI) er mye brukt til å vurdere immunforsvaret i Arabidopsis og har vært integrert i identifisering av flere viktige komponenter i immun signalering inkludert PRRs14,15 ,16. Derfor er dette papiret i tillegg presenterer en analyse for mønster-utløst SGI i Arabidopsis, der frøplanter dyrkes i multi-brønn plater som inneholder standard Media eller Media supplert med en immun elicitor for 8-12 dager og deretter veide ved hjelp av en analytisk målestokk.

For å demonstrere hvordan ROS og SGI analyser kan brukes til å overvåke PRR-mediert signalering, tre genotyper som representerer varierende uimottakelig utganger ble valgt: (1) den ville typen Arabidopsis tiltredelse Columbia (Col-0), (2) den dominerende-negative bak1-5 mutant der multi-funksjonell PRR co-reseptor BRASSINOSTEROID ufølsom 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) er ikke-funksjonell i immun signalering17,18, og (3) den resessivt cpk28-1 mutant, som mangler regulatoriske protein kalsium-avhengige protein KINASE 28 (CPK28) og viser økt immun-utløst svar19,20. ROS og SGI analyser er presentert som svar på en syntetisk-produsert elf18 peptid epitope av bakteriell forlengelse Factor Tu (EF-TU), anerkjent i Arabidopsis av PRR EF-Tu RESEPTOR (EFR)15. Disse protokollene kan brukes med andre immune elicitors som bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogene Plant Elicitor proteiner (AtPeps)16, men det bør bemerkes at plante respons varierer avhengig av elicitor21. Sammen kan ROS og SGI analyser brukes for rask og kvantitativ vurdering av tidlig og sent PRR-mediert svar.

Protocol

1. påvisning av ROS brast i Arabidopsis Leaf plater etter immune elicitation Plant vekst og vedlikehold. For å synkronisere spire, Stratify Arabidopsis frø ved å suspendere ca 50 frø i 1 mL sterilt 0,1% agar [w/v] og lagre ved 4 ° c (ikke lys) for 3-4 dager.Merk: Stratify en vill type bakgrunn kontroll (for eksempel Col-0) og genotyper med høy og lav immun utganger (for eksempel cpk28-1 og bak1-5, henholdsvis) å tjene som interne kontroller. Så…

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 og bak1-517,18 planter ble brukt til å demonstrere forventede utfall for genotyper med høye og lave immunresponser, henholdsvis i oksidativt utbrudd og SGI analyser i forhold til en vill-type bakgrunns kontroll (Col-0). For å vurdere dose avhengige effekter, en 10-fold peptid fortynning serie (1-1000 nM) av elf18 ble brukt. Som forv…

Discussion

Dette papiret beskriver to metoder for assaying av mønster-utløst immunresponser i Arabidopsis, tilbyr kvantitative tilnærminger til evaluering av immunforsvaret uten bruk av spesialisert utstyr. I kombinasjon, mønster-utløst ROS og SGI kan brukes til å vurdere tidlig og sent svar på mikrobe persepsjon, henholdsvis.

Den store begrensningen av oksidativt burst-analysen er variasjon. Av grunner som ikke er helt forstått, absolutt RLU ofte forskjellig med en størrelsesorden mell…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbeid i laboratoriet vårt er finansiert gjennom naturressurser og engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery program, den kanadiske stiftelsen for innovasjon John R. Evans Leader ‘ s Fund, og Queen ‘ s University. KS og er støttes av tandem Ontario Graduate stipender og NSERC Canada Graduate stipend for Master ‘ s Students (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition
check_url/59437?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image