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Abstract
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Immunology and Infection

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.

Abstract

Pflanzen haben ein robustes Immunsystem entwickelt, um Krankheitserreger wahrzunehmen und vor Krankheiten zu schützen. Dieses Papier beschreibt zwei Assays, die verwendet werden können, um die Stärke der Immunaktivierung in Arabidopsis thaliana nach der Behandlung mit Elicitor-Molekülen zu messen. Präsentiert zuerst ist eine Methode zur Erfassung der schnell induzierten und dynamischen oxidativen Burst, die mit einem Luminol-basierten Assay überwacht werden kann. Präsentiert zweite ist eine Methode, die beschreibt, wie immuninduzierte Hemmung des Sämlingswachstums zu messen. Diese Protokolle sind schnell und zuverlässig, erfordern keine spezielle Ausbildung oder Ausrüstung und sind weit verbreitet, um die genetische Grundlage der Pflanzenimmunität zu verstehen.

Introduction

Um Krankheitserreger wahrzunehmen und zu verteidigen, haben Pflanzen membrangebundene Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) entwickelt, die konservierte mikrobielle Moleküle außerhalb der Zelle detektieren, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster (MAMPs) bekannt sind1. Die Bindung von MAMPs an ihre kognaatierten PRRs initiiert proteinkinasevermittelte Immunsignalisierung, was zu einer Breitspektrum-Krankheitsresistenz2führt. Eine der frühesten Reaktionen nach der PRR-Aktivierung ist die Phosphorylierung und Aktivierung von integralen Plasmamembran-RESPIRATORY-BURST-OXIDASE-HOMOLOG(RBOH)-Proteinen, die die Produktion extrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) katalysieren 3 , 4. ROS spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung von Krankheitsresistenz, sowohl als sekundäre Botenstoffe zur Verbreitung von Immunsignalisierung als auch als direkte antimikrobielle Wirkstoffe5. Die erste Beobachtung eines immunentlösten oxidativen Bursts wurde mit Kartoffelknollen von cv. Rishiri nach Phytophthora infestans Inokulation6beschrieben. Die ROS-Produktion wurde in mehreren Pflanzenarten mit Blattscheiben7, Zellsuspensionskulturen8und Protoplasten6. Beschrieben hier ist eine einfache Methode für die Assaying Muster-ausgelöste ROS-Produktion in Blattscheiben von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Als Reaktion auf die MAMP-Wahrnehmung katalysieren aktivierte RBOH-Proteine die Produktion von Superoxid-Radikalen (O2–), Hydroxylradikalen (•OH) und Singlet-Sauerstoff (1O2 ), die in Wasserstoffperoxid umgewandelt werden (H2 O 2) im extrazellulären Raum9. H2O2 kann durch Luminol-basierte Chemilumineszenz in Gegenwart des Oxidationsmittels Meerrettichperoxidase (HRP)10quantifiziert werden. HRP oxidiertH2O2 und erzeugt ein Hydroxid-Ion (OH) und Sauerstoffgas (O2 ), die mit Luminol reagieren, um ein instabiles Zwischenprodukt zu erzeugen, das ein Photon von Licht10freisetzt. Photonenemission kann als relative Lichteinheiten (RLUs) mit einem Mikroplattenleser oder Imager quantifiziert werden, der in der Lage ist, Lumineszenz zu erkennen, die in den meisten molekularen Laboratorien zu Standardgeräten geworden sind. Durch die Messung des Lichts, das über ein 40-60-Minuten-Intervall erzeugt wird, kann ein transienter oxidativer Ausbruch bereits 2-5 Minuten nach der Behandlung des Entauslöserers erkannt werden, der bei 10-20 Minuten seinen Höhepunkt erreicht und nach 60 Minuten11auf basale Werte zurückkehrt. Das kumulative Licht, das in diesem Zeitverlauf erzeugt wird, kann als Maß für die Immunstärke verwendet werden, das der Aktivierung von RBOH-Proteinen12entspricht. Praktischerweise erfordert dieser Test keine spezielle Ausrüstung oder umständliche Probenvorbereitung.

Kurz nach dem MAMP-Nachweis gilt der oxidative Ausbruch als frühe Immunantwort, zusammen mit der MAPK-Aktivierung und der Ethylenproduktion5. Spätere Immunantworten sind Transkriptionsreprogrammierung, stomataler Verschluss und Calloseablagerung2,5. Eine längere Exposition gegenüber MAMPs aktiviert kontinuierlich energetisch-kostenintensive Immunsignale, was zur Hemmung des Pflanzenwachstums führt, was auf einen Kompromiss zwischen Entwicklung und Immunität13hindeutet. Musterausgelöste Sättlingswachstumshemmung (SGI) wird häufig zur Beurteilung der Immunleistung bei Arabidopsis verwendet und war integraler Bestandteil der Identifizierung mehrerer Schlüsselkomponenten der Immunsignalisierung, einschließlich PRRs14,15 ,16. Daher präsentiert dieses Papier zusätzlich einen Test für musterausgelöste SGI in Arabidopsis, wobei Sämlinge in Multi-Well-Platten angebaut werden, die Standardmedien oder Medien enthalten, die 8-12 Tage lang mit einem Immunenteliciter ergänzt und dann gewogen werden. mit einer analytischen Skala.

Um zu demonstrieren, wie ROS- und SGI-Assays zur Überwachung der PRR-vermittelten Signalisierung verwendet werden können, wurden drei Genotypen ausgewählt, die unterschiedliche Immunausgänge darstellen: (1) der wilde Typ Arabidopsis Beitritt Columbia (Col-0), (2) der dominant-negative Bak1-5 Mutant, bei dem der multifunktionale PRR-Co-Rezeptor BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) bei der Immunsignalisierung17,18und (3) dem rezessiven cpk28-1 Mutanten, dem die CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) und zeigt erhöhte immunausgelöste Reaktionen19,20. ROS- und SGI-Assays werden als Reaktion auf ein synthetisch hergestelltes elf18-Peptid-Epitop des bakteriellen Dehnungsfaktors Tu (EF-Tu) vorgestellt, das in Arabidopsis vom PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15anerkannt wird. Diese Protokolle können mit anderen Immunentfernern wie dem bakteriellen Motilitätsprotein Flagellin14 oder endogenen Pflanzenelicitor-Proteinen (AtPeps)16verwendet werden, es sollte jedoch beachtet werden, dass die Reaktionsfähigkeit der Pflanzen je nach Elicitor21. Zusammen können ROS- und SGI-Assays für die schnelle und quantitative Bewertung früher und später PRR-vermittelter Reaktionen verwendet werden.

Protocol

1. Erkennung von ROS-Burst in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunentlösung Pflanzenwachstum und -wartung. Um die Keimung zu synchronisieren, schichten Sie Arabidopsis Samen, indem Sie etwa 50 Samen in 1 ml sterilem 0,1% Agar [w/v] aussetzen und 3-4 Tage bei 4 °C (kein Licht) lagern.ANMERKUNG: Stratify eine Wildtyp-Hintergrundsteuerung (z. B. Col-0) und Genotypen mit hohen und niedrigen Immunausgängen (z. B. cpk28-1 bzw. bak1-5), um als interne Kontrollen zu di…

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 und bak1-517,18 Pflanzen wurden verwendet, um erwartete Ergebnisse für Genotypen mit hohen und niedrigen Immunantworten zu demonstrieren, bzw. in oxidativen Burst und SGI Tests relativ zu einem Wildtyp-Hintergrundsteuerelement (Col-0). Zur Beurteilung dosisabhängiger Wirkungen wurde eine 10-fache Peptidverdünnungsreihe (1-1.000 nM) …

Discussion

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Beurteilung von mustergesteuerten Immunantworten in Arabidopsis, die quantitative Ansätze zur Bewertung der Immunleistung ohne den Einsatz spezieller Geräte anbieten. In Kombination können mustergesteuerte ROS und SGI verwendet werden, um frühe bzw. späte Reaktionen auf die Mikrobenwahrnehmung zu bewerten.

Die Hauptbeschränkung des oxidativen Burst-Assays ist die Variabilität. Aus Gründen, die nicht vollständig verstanden werden, unt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit in unserem Labor wird durch das Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, die Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader es Fund und die Queen es University finanziert. KS und IS werden durch Tandem Ontario Graduate Scholarships und NSERC Canada Graduate Scholarships für Master-Studenten (CGS-M) unterstützt.

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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