JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

Este artículo describe dos métodos para cuantificar las respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana después de la exposición a los impulsores inmunes: la ráfaga oxidativa transitoria y la inhibición del crecimiento de la plántula.

Abstract

Las plantas han desarrollado un sistema inmunitario robusto para percibir patógenos y protegerse contra las enfermedades. Este artículo describe dos ensayos que se pueden utilizar para medir la fuerza de la activación inmune en Arabidopsis thaliana después del tratamiento con moléculas de eliitor. Presentado primero es un método para capturar la ráfaga oxidativa dinámica y inducida rápidamente, que se puede monitorear usando un ensayo a base de luminol. El segundo presentado es un método que describe cómo medir la inhibición inducida por el inmune del crecimiento de las plántulas. Estos protocolos son rápidos y confiables, no requieren capacitación especializada o equipo, y se utilizan ampliamente para entender la base genética de la inmunidad de las plantas.

Introduction

Para percibir y defenderse de patógenos, las plantas han evolucionado receptores de reconocimiento de patrones ligados a la membrana (PRR) que detectan moléculas microbianas conservadas fuera de la célula conocida como patrones moleculares asociados a microbios (MMP)1. La unión de los MAPP a sus PRR cognados inicia la señalización inmunemediada por proteínas quinasa, lo que da como resultado una resistencia a las enfermedades de amplio espectro 2. Una de las primeras respuestas después de la activación de PRR es la fosforilación y activación de proteínas de membrana plasmática integral RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalizan la producción de especies de oxígeno reactivo extracelular (ROS)3 , 4. ROS desempeña un papel importante en el establecimiento de la resistencia a la enfermedad, actuando tanto como mensajeros secundarios para propagar la señalización inmune como agentes antimicrobianos directos5. La primera observación de una ráfaga oxidativa inmune provocada se describió utilizando tubérculos de patata de cv. Rishiri después de la inoculación de Phytophthora infestans 6. La producción de ROS se ha evaluadoen varias especies vegetales utilizando discos de hojas 7, cultivos de suspensión celular8y protoplastias6. Aquí se describe un método simple para la determinación de la producción de ROS activada por patrones en discos de hojas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Como respuesta a la percepción de MAMP, las proteínas RBOH activadas catalizan la producción de radicales de superóxido (O2–), radicales hidroxilo (•OH) y oxígeno singlete (1O2) que se convierten en peróxido de hidrógeno (H2O 2) en el espacio extracelular9. H2O2 se puede cuantificar mediante quimioluminiscencia a base de luminol en presencia del agente oxidante de peroxidasa de rábano picante (HRP)10. HRP oxida H2O2 generando un ion hidróxido (OH)y gas oxígeno (O2) que reaccionan con luminol para producir un intermedio inestable que libera un fotón de luz10. La emisión de fotones se puede cuantificar como unidades de luz relativa (RPU) utilizando un lector de microplacas o un imager capaz de detectar luminiscencia, que se han convertido en piezas estándar de equipos en la mayoría de los laboratorios moleculares. Mediante la medición de la luz producida en un intervalo de 40-60 minutos, se puede detectar una ráfaga oxidativa transitoria tan pronto como 2-5 minutos después del tratamiento del elicitor, alcanzando un máximo de 10-20 minutos y volviendo a los niveles basales después de 60 minutos11. La luz acumulativa producida a lo largo de este tiempo puede utilizarse como medida de la fuerza inmune correspondiente a la activación de las proteínas RBOH12. Convenientemente, este ensayo no requiere equipo especializado o preparación de muestras engorrosa.

Alcanzando el pico poco después de la detección de MAMP, la ráfaga oxidativa se considera una respuesta inmune temprana, junto con la activación mapK y la producción de etileno5. Las respuestas inmunitarias posteriores incluyen la reprogramación transcripcional, el cierre estomatal y la deposición de callosa2,5. La exposición prolongada a los MamPS activa continuamente la señalización inmune energéticamente costosa que resulta en la inhibición del crecimiento de las plantas, indicando un equilibrio entre el desarrollo y la inmunidad13. La inhibición del crecimiento de las plántulas activada por patrones (SGI) se utiliza ampliamente para evaluar la producción inmunitaria en Arabidopsis y ha sido parte integral de la identificación de varios componentes clave de la señalización inmune, incluidos los PRR14,15 ,16. Por lo tanto, este artículo presenta además un ensayo para SGI activado por patrón en Arabidopsis,por el cual las plántulas se cultivan en placas multipocillos que contienen medios estándar o medios complementados con un elicitor inmune durante 8-12 días y luego se pesan utilizando una escala analítica.

Para demostrar cómo se pueden utilizar los ensayos ROS y SGI para monitorear la señalización mediada por PRR, se eligieron tres genotipos que representan diferentes salidas inmunitarias: (1) el tipo salvaje Arabidopsis adhesión Columbia (Col-0), (2) el bak1-5 dominante-negativo mutante en el que el coreceptor multifuncional PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) no es funcional en la señalización inmune17,18,y (3) el mutante recesivo cpk28-1, que carece de la proteína reguladora CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) y muestra respuestas inmunitarias activadas19,20. Los ensayos ROS y SGI se presentan en respuesta a un epítopo de péptido elf18 producido sintéticamente de Factor de elongación bacteriano Tu (EF-Tu), reconocido en Arabidopsis por el PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Estos protocolos se pueden utilizar con otros eliitores inmunes como la proteína de motilidad bacteriana flagelina14 o las proteínas endógenas del elicitor vegetal (AtPeps)16, sin embargo, debe tenerse en cuenta que la capacidad de respuesta de la planta difiere dependiendo de la elicitor21. Juntos, los ensayos ROS y SGI se pueden utilizar para la evaluación rápida y cuantitativa de las respuestas mediadas por PRR tempranas y tardías.

Protocol

1. Detección de ráfaga de ROS en los discos de la hoja de Arabidopsis después de la elicitation inmune Crecimiento y mantenimiento de la planta. Para sincronizar la germinación, estratificar las semillas de Arabidopsis suspendiendo aproximadamente 50 semillas en 1 ml de agar estéril 0.1% [w/v] y almacenar a 4oC (sin luz) durante 3-4 días.NOTA: Estratifica ralentí un control de fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) y genotipos con salidas inmunes altas y bajas (por ejemp…

Representative Results

Mutantes cpk28-119,25 y bak1-517,se utilizaron18 plantas para demostrar los resultados esperados para los genotipos con respuestas inmunitarias altas y bajas, respectivamente, en ráfaga oxidativa y SGI ensayos relativos a un control de fondo de tipo salvaje (Col-0). Para evaluar los efectos dependientes de la dosis, se utilizó una serie de dilución de …

Discussion

Este artículo describe dos métodos para evaluar las respuestas inmunitarias activadas por patrones en Arabidopsis,ofreciendo enfoques cuantitativos para evaluar la producción inmune sin el uso de equipos especializados. En combinación, ROS y SGI activados por patrones se pueden utilizar para evaluar las respuestas tempranas y tardías a la percepción de los microbios, respectivamente.

La principal limitación del ensayo de ráfaga oxidativa es la variabilidad. Por razones que no …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo en nuestro laboratorio se financia a través del Programa de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Recursos Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), el Fondo de Líderes John R. Evans de la Fundación Canadiense para la Innovación y la Universidad de Queen. KS e IS cuentan con el apoyo de becas de posgrado en tándem Ontario y becas de posgrado NSERC Canadá para estudiantes de maestría (CGS-M).

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops – production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Tags

Arabidopsis ThalianaPattern-triggeredOxidative BurstSeedling Growth InhibitionImmune OutputsPlant GenotypesLaboratory EquipmentLeaf DiscsElicitorsReactive Oxygen SpeciesMicroplate ReaderMS MediumSeedling GrowthGrowth Inhibition
check_url/59437?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image