Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes
Summary
Een eenvoudige en betrouwbare dieet-geïnduceerde knaagdier model voor niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) wordt beschreven, bereikt door niet-SPF huisvesting van de dieren en het beheer van een specifieke high-fat dieet. Wij beschrijven de identificatie van de lever-en vetweefsel immuun cel subsets aan recapituleren menselijke immunologische omstandigheden door bloot muizen aan milieu-kiemen.
Abstract
Obesitas wordt geassocieerd met chronische low-grade ontsteking en insulineresistentie, bij te dragen tot een toenemende prevalentie van chronische metabole ziekten, zoals type 2 diabetes en niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH). Recent onderzoek heeft vastgesteld dat pro-inflammatoire immuun cellen infiltreren zwaarlijvige hypertrofische vetweefsel en lever. Gezien het opkomende belang van immune cellen in de context van metabolische homeostase, is er een kritieke behoefte om hun wijziging tijdens de ontwikkeling van type 2 diabetes en NASH te kwantificeren en te karakteriseren. Echter, dierlijke modellen die induceren pathofysiologische kenmerken van de menselijke NASH zijn schaars.
In dit artikel, bieden wij een gedetailleerd protocol te identificeren immuun cel subsets geïsoleerd van lever en vetweefsel in een betrouwbare muismodel van NASH, opgericht door de huisvesting van high-fat Diet (HFD) muizen onder niet-specifieke pathogeen-vrije (SPF) voorwaarden zonder een ten minste zeven weken. We demonstreren de behandeling van muizen in niet-SPF-omstandigheden, de spijsvertering van de weefsels en de identificatie van macrofagen, Natural Killer (NK) cellen, dendritische cellen, B en T-cel subsets door flow Cytometry. Representatieve flow Cytometry percelen van SPF HFD muizen en niet-SPF muizen zijn voorzien. Voor het verkrijgen van betrouwbare en interpreterende gegevens, het gebruik van antilichamen, nauwkeurige en precieze methoden voor de spijsvertering en de juiste gating in flow Cytometry experimenten zijn kritische elementen.
De interventie om de blootstelling van fysiologische antigeen bij muizen te herstellen door ze te bewonen in niet-SPF-omstandigheden en onspecifieke blootstelling aan microbiële antigenen kan een relevant hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van het verband tussen immunologische veranderingen, dieet-geïnduceerde obesitas en aanverwante complicaties op lange termijn.
Introduction
Obesitas is een multifactoral stoornis en een belangrijke risicofactor voor het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, beroerte, niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) en sommige vormen van kanker. De prevalentie van obesitas neemt wereldwijd snel toe. Vandaag, 2.100.000.000 mensen-bijna 30% van de wereldbevolking-zijn ofwel zwaarlijvig of overgewicht1. Obesitas-geassocieerde insulineresistentie kan leiden tot T2D, wanneer uitgeput pancreas Islet beta cellen niet te compenseren voor de toegenomen behoefte aan insuline te handhaven glucose homeostase2.
Vetweefsel is samengesteld uit verschillende soorten cellen, waaronder adipocyten, endothelial cellen, fibroblasten en immuun cellen. Tijdens de progressie van obesitas, veranderingen in het aantal en de activiteit van het immuunsysteem cellen kan leiden tot een lage-grade ontsteking van hypertrofische vetweefsel3,4. Concreet is gebleken dat overmatige energie-inname, begeleid door chronisch verhoogde niveaus van bloedglucose, triglyceriden en vrije vetzuren, leidt tot adipocyte hypoxie, endoplasmatisch reticulum stress, verminderde mitochondriale functie en verbeterde cytokine secretie, resulterend in de activering van pro-inflammatoire vetweefsel immuun cellen5,6. Afgelopen onderzoek is vooral gericht op aangeboren immuniteit, maar meer recentelijk adaptieve immuun cellen (T en B-cellen) zijn ontstaan als belangrijke regulatoren van glucose homeostase. Zij bezitten ontstekings (met inbegrip van CD8+ T cellen, Th1, en de cellen van B) of hoofdzakelijk regelgevende functies (met inbegrip van regelgevende T (Treg) cellen, Th2 cellen) en kunnen zowel verergeren of beschermen tegen insulineweerstand7,8 , 9.
Voorts werden verscheidene mechanismen voorgesteld om te verklaren hoe de zwaarlijvigheid Steatohepatitis, met inbegrip van verhoogde productie van cytokines door vetweefsel10toeneemt. NASH, de progressieve vorm van niet-alcoholische vervetting van de leverziekte en een grote gezondheids last in de ontwikkelde landen, is histologisch gekenmerkt door ballon hepatocyten, lipide accumulatie, fibrose en pericellular ontsteking en kan vooruitgang te cirrose, eindstadium leverziekte of hepatocellulair carcinoom. Verschillende regimes (bijvoorbeeld de methionine en choline gebrekkig dieet11) is bekend dat Nash-achtige lever pathologie induceren in niet-menselijke dierlijke modellen, maar de meeste van deze benaderingen niet recapituleren menselijke omstandigheden van Nash en de metabole gevolgen als ze ofwel vereisen specifieke gen knock-out, niet-fysiologische dieet manipulaties of gebrek aan insulineresistentie typisch voor de mens NASH. Bovendien is ons begrip van de onderliggende mechanismen van metabole ziekten momenteel gebaseerd op experimenten uitgevoerd met laboratoriummuizen gehuisvest onder standaard specifieke pathogeen vrije (SPF) voorwaarden. Die barrière faciliteiten zijn abnormaal hygiënisch en beschouwen niet de microbiële diversiteit mensen moeten ontmoeten, die voor moeilijkheden in het vertaalproces van dierlijke studies aan klinische benaderingen kunnen rekenschap nemen12,13 , 14.
Om de verschillende immune cel subsets in vetweefsel en lever tijdens de ontwikkeling van insulineweerstand en NASH in een geavanceerd muismodel te onderzoeken dat menselijke immunologische voorwaarden reproduceert, werden de muizen gehuisvest in individuele kooien in semi steriel omstandigheden zonder barrière. De muizen die onder antigeen blootgestelde voorwaarden worden gehuisvest ontwikkelden NASH-als lever pathologie reeds na 15 weken van high-fat dieet (HFD) het voeden13. Vergeleken met leeftijds gematchte SPF muizen ontwikkelden zij macrovesicular steatose, lever infiltratie en activering van immune cellen.
Dit manuscript beschrijft een robuuste flow Cytometry analyse te definiëren en te tellen immune cel subsets van muis vetweefsel en lever in een model van NASH. Flow Cytometry analyse maakt het mogelijk de detectie van meerdere parameters van individuele cellen gelijktijdig in tegenstelling tot RT-PCR of Immunohistochemistry benaderingen.
Samengevat, onze studie biedt een muismodel van korte-termijn HFD voor het onderzoek naar de ontwikkeling van insulineresistentie en NASH en de onderliggende mechanismen die ook vertoont trouw aan de menselijke conditie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steatohepatitis heeft een sterke associatie met metabole afwijkingen zoals obesitas, insulineresistentie en dyslipidemie15. De veelvoudige studies wijzen erop dat de ontsteking van het vetweefsel de pathogenese van type 2 diabetes, met inbegrip van veranderde niveaus van cellen van zowel het aangeboren als aanpassings immune systeem4,5,16,17 kan drijven . Daarnaast is ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin witte en Cornelia Heckmann voor hulp bij experimentele procedures en Benjamin Tiburzy van biolegend voor nuttige opmerkingen over de gating strategie. J.S. werd ondersteund door de Helmholtz Grant (ICEMED). Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Clinical Research Unit van het Berlijnse Instituut voor volksgezondheid (BIH), de “Miguel-Grant” van het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek en de Einstein Foundation. KERCKHOFS-B. en H.-Daphne worden gefinancierd door FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
