Summary

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

Published: April 26, 2019
doi:

Summary

Alkolsüz steatohepatiti için basit ve güvenilir bir diyet kaynaklı kemirgen hayvan modeli (NASH) tarif edilir, hayvanlar ve özel bir yüksek yağ diyet uygulanması SPF olmayan konut aracılığıyla elde. Biz karaciğer ve adipoz immün hücre alt kümeleri tanımlamak için insan immünolojik koşulları farları çevresel mikroplar maruz tarafından yeniden tanımlamakta.

Abstract

Obezite kronik düşük dereceli inflamasyon ve insülin direnci ile ilişkilidir, tip 2 diyabet ve alkolsüz steatohepatitler (NASH) gibi kronik metabolik hastalıkların artan prevalansı katkıda bulunur. Son araştırmalar, Pro-inflamatuar immün hücrelerin obez hipertrofik yağ dokusu ve karaciğer infiltrasyon kurdu. Metabolik homeostaz bağlamında bağışıklık hücrelerinin ortaya çıkan önemi göz önüne alındığında, kritik bir ihtiyaç türü 2 diyabet ve NASH gelişimi sırasında değişiklik ölçmek ve karakterize etmektir. Ancak, insan NASH tipik patofizyolojik özellikleri neden hayvan modelleri seyrek vardır.

Bu yazıda, yüksek yağlı diyet (HFD) fareler tarafından kurulan, özel olmayan patojen içermeyen (SPF) koşullar altında, bir NASH ‘in güvenilir bir fare modelinde karaciğer ve adipoz dokusundan izole edilen bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. en az yedi hafta için bariyer. SPF olmayan koşullarda farelerin işlenmesini, dokuların sindirimi ve makrofajların, doğal katil (NK) hücrelerinin, dendritik hücrelerin, B ve T hücresi alt setlerinin akış sitometri tarafından belirlenmesini gösteriyoruz. SPF HFD fareler ve SPF olmayan farelerden temsilci akış sitometri araziler sağlanmaktadır. Güvenilir ve yorumlanabilir veriler elde etmek için, antikorların kullanımı, doku sindirimi için doğru ve hassas Yöntemler ve akış sitometri deneylerinde uygun şekilde gating önemli unsurlardır.

SPF dışı koşullarda ve mikrobiyal antijenlere spesifik olmayan maruz kalmalarına neden olan farelerde fizyolojik antijen pozlamasını geri yükleme müdahalesi, immünolojik değişiklikler arasındaki bağlantıyı araştırmak için ilgili bir araç sağlayabilir, diyet kaynaklı Obezite ve ilgili uzun vadeli komplikasyonlar.

Introduction

Obezite multifokal bir bozukluk ve kalp hastalığı, inme, alkolsüz steatohepatit (NASH), tip 2 diyabet (T2D) ve bazı kanser türleri geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür. Obezite prevalansı hızla küresel olarak artmaktadır. Bugün, 2.100.000.000 kişi-dünyanın nüfusu yaklaşık% 30-ya obez ya da kilolu1vardır. Obezite-ilişkili insülin direnci T2D için yol açabilir, zaman tükenmiş pankreatik Islet Beta hücreleri glikoz homeostazı korumak için insülin için artan ihtiyaç telafi etmek için başarısız2.

Adipoz dokusu adipanosit, endotel hücreler, fibroblastlar ve immün hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre türlerinden oluşur. Obezitenin ilerlemesi sırasında, immün hücrelerin sayısının ve aktivitesindeki değişiklikler hipertrofik adipoz dokusunun düşük dereceli iltihaplanmasına yol açabilir3,4. Özellikle, aşırı enerji alımı, kronik yüksek kan şekeri, trigliserid ve serbest yağ asitleri seviyeleri ile birlikte, adiposit hipoksi, endoplazmik retikulum stres, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon ve yol açar bulunmuştur Gelişmiş sitokin salgılanması, Pro-inflamatuar yağ immün hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanan5,6. Geçmiş araştırmalar esas olarak doğuştan gelen bağışıklık odaklı, ama daha yakın zamanda adaptif bağışıklık hücreleri (T ve B hücreleri) glikoz homeostaz önemli regülatörler olarak ortaya çıkmıştır. İnflamatuar (CD8+ T hücreleri, Th1 ve B hücreleri dahil) veya öncelikle düzenleyici fonksiyonlar (düzenleyici T (Treg) hücreleri, TH2 hücreleri dahil) ve hem şiddetlendirebilir ya da insülin direnci karşı korumak7,8 , 9‘ a kadar.

Ayrıca, obezite steatohepatiti nasıl artırdığını açıklamak için çeşitli mekanizmalar önerildi, adipoz dokusu ile sitokinlerin artan üretimi de dahil olmak üzere10. Fizyolojik olmayan yağlı karaciğer hastalığının ilerici formu ve gelişmiş ülkelerde büyük bir sağlık yükünü kullanarak histolojik olarak balonlu hepatositler, lipid birikimi, fibrozis ve perikelüler inflamasyon ile karakterize edilir ve Siroz, son aşama karaciğer hastalığı veya hepatosellüler karsinom. Çeşitli rejim (örneğin metiyonin ve kolin eksikliği diyet11) olmayan insan hayvan modellerinde Nash benzeri karaciğer patolojisine neden olduğu bilinmektedir, ama bu yaklaşımların çoğu Nash insan koşulları ve metabolik özetlemek yok Onlar ya spesifik gen nakavt, fizyolojik olmayan diyet manipülasyonları veya eksikliği insülin direnci insan NASH tipik gerektirir gibi sonuçlar. Ayrıca, metabolik hastalıkların temel mekanizmalarının anlayışımız Şu anda standart spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında bulunan laboratuar fareler ile yürütülen deneyler dayanmaktadır. Bu bariyer tesisleri anormal hijyen ve insanlar karşılaşmak zorunda mikrobiyal çeşitlilik dikkate değil, hangi klinik yaklaşımlar hayvan çalışmaları çeviri sürecinde zorluklar için hesap olabilir12,13 , 14oldu.

İnsan immünolojik koşulları üreten gelişmiş bir fare modelinde insülin direnci ve Nash gelişimi sırasında adipoz doku ve karaciğer farklı immün hücre alt kümeleri araştırmak için, fareler yarı steril bireysel kafeslerde yer aldı Bariyersiz koşullar. Fareler antijen maruz koşullar altında bulunan NASH-benzeri karaciğer patolojisi zaten 15 hafta yüksek yağlı diyet (HFD) besleme13sonra geliştirilmiştir. Yaş eşlemeli SPF fareler ile karşılaştırıldığında macrovesicular steatosis, hepatik infiltrasyon ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu geliştirdi.

Bu yazıda, NASH modelinde fare adipoz dokusu ve karaciğerinden bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlamak ve saymak için sağlam bir akış sitometri Analizi açıklanmaktadır. Akış sitometri analizi, RT-PCR veya immünhistokimya yaklaşımlarının aksine, tek hücrelerin birden çok parametrenin aynı anda algılanmasını sağlar.

Özetle, bizim çalışma insülin direnci ve NASH ve aynı zamanda insan durumuna sadakat sergiler altta yatan mekanizmaları gelişimini araştırmak için kısa vadeli HFD bir fare modeli sunuyor.

Protocol

Bu çalışma, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi gözetiminde Ulusal Sağlık Enstitüleri ve hayvan refah Yasası ‘nın bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı kılavuzu ‘Na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri, Almanya ‘nın Charité Berlin ‘in kurumsal etik yönergelerine göre yürütülmüştür ve Landesamt für Gesundheit und soziales tarafından onaylanmış ve VARıŞ yönergelerine uymalıdır. 1. diyet kaynaklı hayvan modeli steatohepatiti</…

Representative Results

Açıklanan protokol, diyet kaynaklı NASH modelinde murine perigonadal adipoz doku ve karaciğerden izole edilmiş, doğuştan ve adaptif immün hücrelerin yüzey işaretleyicilerinin karakterize edilmesini sağlar. Bu modelde, Nash HFD artı sakaroz (% 6) yönetimi ile indüklenmiş oldu İçme suyunda 7 ila 15 hafta C57Bl/6J fareler, daha önce bildirilen13. Önemlisi, fareler yarı steril koşullarda yer aldı ve böylece, deney boyunca çevresel antijenlere maruz. SPF koşullarında yer alan…

Discussion

Steatohepatitin obezite, insülin direnci ve dislipidemi15gibi metabolik anomaliler ile güçlü bir ilişkisi vardır. Çoklu çalışmalar, yağ doku iltihabı tip 2 diyabet patogenezi sürücü olduğunu gösterir, hem doğuştan ve adaptif bağışıklık sistemi hücreleri değişen seviyeleri de dahil olmak üzere4,5,16,17 . Buna ek olarak, obezite karaciğer kompl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz deneysel prosedürler ve gating stratejisi üzerinde yararlı yorumlar için Biolegend gelen Benjamin Tiburzy yardım için Anke hukuk, Diana Woellner, Dr Kathrin Witte ve Cornelia Heckmann teşekkür ederiz. JS, Helmholtz Grant (ıCEMED) tarafından destekleniyordu. Bu çalışmada, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı ve Einstein Vakfı tarafından “BCRT-Grant” Berlin Sağlık Enstitüsü (BH) klinik araştırma birimi ‘nden hibe tarafından destekleniyordu. KAHRAMAN-B. ve H.-D.V. tarafından finanse edilir FOR2165.

Materials

100µm cell strainers  Falcon 352340
1ml syringe  BD   309659
26G x 5/8 needles  BD  305115
35mm Petri Dishes  Falcon 353001
40µm cell strainers  Falcon 352340
ACK lysis buffer  GIBCO A1049201
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 Biolegend  103127 AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)
Analysis software  FlowJo 10.0.8 software
APC anti-mouse CD11c Antibody Biolegend  117309 AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody Biolegend  138411 AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)
BV421 anti-mouse CD127 Antibody Biolegend  135023 AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)
BV421 anti-mouse F4/80 Antibody Biolegend  123131 AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody Biolegend  135219 AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)
BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody Biolegend  108739 AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)
BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody Biolegend  101239 AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)
BV711 anti-mouse/human B220 Antibody Biolegend  103255 AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)
BV785 anti-mouse CD8a Antibody Biolegend  100749 AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old  Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2  Charité – Universitätsmedizin Berlin A119.1 
Collagenase NB 4G Proved Grade  SERVA  11427513
Collagenase Typ I  Worthington  LS004197
Conical centrifuge tube 15ml  Falcon 352096
Conical centrifuge tube 50ml  Falcon 352070
DNAse   Sigma-Aldrich  4716728001
Fetal bovine serum  Biochrom S0115
Filter 30µm  Celltrics  400422316
FITC anti-mouse CD3 Antibody Biolegend  100203 AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)
Flow cytometry  BD-LSR Fortessa 
Forceps  Sigma-Aldrich  F4142-1EA
HBSS  Bioanalytic GmBH  085021-0500 
High-fat diet  SSNIF E15741–34  60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates
micro dissecting scissors  Sigma-Aldrich  S3146 used for dissection purposes 
PE anti-mouse CD25 Antibody Biolegend  101903 AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)
PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody Biolegend  104417 AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody Biolegend  107629 AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody Biolegend  100565 AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll solution  Biochrom L6115
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody Biolegend  103031 AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody Biolegend  108427 AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)
Phosphate buffered saline  Gibco 12559069
Round-Bottom Tubes with cell strainer cap STEMCELL Technologies  38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32 Biolegend  101301 AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Trypan Blue  Sigma-Aldrich  T6146
Zombie NIR Fixable Viability Kit Biolegend  423105 viablity stain 

References

  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
  2. Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
  3. Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
  5. Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
  6. Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
  7. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
  8. Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  9. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
  10. Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
  11. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  12. Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  13. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
  14. Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
  15. Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
  16. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  17. Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
  18. Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
  19. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
  20. Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
  21. Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).

Play Video

Cite This Article
Sbierski-Kind, J., Schmidt-Bleek, K., Streitz, M., Kath, J., Spranger, J., Volk, H. An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes. J. Vis. Exp. (146), e59470, doi:10.3791/59470 (2019).

View Video